[发明专利]用于肺炎支原体MLVA分型检测的核苷酸序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于肺炎支原体MLVA 分型检测的核苷酸序列。

背景技术

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是社区获得性呼吸道感染的重要致病菌之一，其感染后的临床表现可以从轻度的咽喉炎、支气管炎到重症间质性肺炎（原发性非典型肺炎）及神经系统、心血管系统并发症等。Mp流行具有周期性，每3-7年在不同地区出现发病率高峰。儿童肺炎中10-30%的病例是Mp引起的，在流行高峰年Mp肺炎可高达30-50%，且流行可持续1-2年。进入21世纪以来，全球性的Mp感染暴发流行已出现了两次，分别在2005-2007年和2010-2012年初发生。Mp感染暴发流行对家庭、学校、部队、社会都会产生较大的经济损失和社会不良影响。

以往Mp基因分型研究主要针对致病相关P1粘附基因，将Mp分为I和II两型，由于分型较少，严重阻碍了对Mp的多态性研究和流行病学监测。

MLVA分型（multiple-locus variable-number tandem-repeat (VNTR) analysis，MLVA）方法利用不同微生物基因组中不同位点串联重复序列（variable-number tandem-repeat，VNTR）数目的不同，对其进行分型，被广泛用于微生物，尤其是细菌的研究。

2009年Dégrange等利用Mp的5个VNTR区成功建立了用于Mp的MLVA分型方法，该方法大大提高了对Mp多态性的分辨能力。由于其中的Mpn1处于高变异区，检测过程中出现了不同传代批次的同一标准株基因型不同、同一患者左右肺部检测Mp基因型不同、同一次感染患者出院前后Mp基因型不同等问题，由于其中各引物序列反应条件不同，检测过程不能在同一反应体系中完成。

发明内容

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种更稳定的高分辨率肺炎支原体MLVA分型检测所需核苷酸引物序列，用于建立适合Mp流行病学监测的Mp基因分型检测方法。针对肺炎支原体4个具有较好分辨能力的VNTR区域-MLVA1（Mpn13），MLVA2（Mpn14），MLVA3（Mpn15），MLVA4（Mpn16），分别设计可用于多重PCR（multiple PCR，mPCR）扩增的特异性核苷酸引物序列，根据4个VNTR区的重复序列数目组合对肺炎支原体进行基因分型，克服原有肺炎支原体MLVA分型方法的弊端，建立一种肺炎支原体MLVA分型方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1.分析两个已知的肺炎支原体标准株M129（1型）和FH（2型），针对4个具有较好分辨能力的VNTR序列-MLVA1，MLVA2，MLVA3，MLVA4，设计特异性核苷酸引物序列，4对核苷酸序列分别为：

MLVA1区域：MLVA1-F：5’GTTTGCTAATTATCTCATGAATGGC3’

           MLVA1-R：5’TGCGCAGTGACAATGCATA3’

MLVA2区域：MLVA2-F：5’AGATGAGCGATCGCTTGG3’

           MLVA2-R：5’TTTCAAAATCGC(T)CAAAAAGC3’

MLVA3区域：MLVA3-F：5’CAACAGCACCACATCTTTAGG3’

           MLVA3-R：5’GCTAATCTTGCAAACGCTGC3’

MLVA4区域：MLVA4-F：5’CCTTGATTGTGGTGTGCTGAG3’

           MLVA4-R：5’GATTCCGCTTAAACTGCAGG3’

2.根据1项中的核苷酸引物序列，特征在于各引物序列具有相近的Tm值，在同一反应体系中引物之间无交叉反应。

3.根据以上1,2项中所述的所有核苷酸序列在肺炎支原体MLVA分型检测中的应用。

4.根据以上1,2项中所述的所有核苷酸序列在肺炎支原体MLVA分型检测试剂盒的应用。