[发明专利]一种杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌工程菌及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一株苏云金芽孢杆菌，更具体涉及一种杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌工程菌的制备方法，同时还涉及一种杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌工程菌在杀虫剂中的用途。 

背景技术

鞘翅目是昆虫纲中最大的一个目，鞘翅目害虫对农林生产的危害仅次于鳞翅目害虫。鞘翅目害虫广泛分布于世界各地(Biodiversity of Coleoptera/Insect biodiversity:science and society，West Sussex:Blackwell Publishing，2009，265-301)。比较常见的如马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）、玉米根叶甲（Diabrotica virgifera）、猿叶虫（Phaedon brassicae Baly）、铜绿丽金龟子（Anomala corpulenta）、柳蓝叶甲（Plagiodera versicolora）、榆蓝叶甲（Pyrrhalta aenescens）等。这些害虫对马铃薯、玉米、蔬菜、农作物、林木等造成严重危害(新疆农业科学,2012,48(12):2217-2222；植物检疫,1997,11(2):101-103；植保技术与推广,1995,(5):29-30；Biological Control,1995,5(2):290-296;东北林业大学学报,2003,31(3):65-66)。目前对鞘翅目害虫的防治大多只能依靠化学农药，化学农药杀虫特异性差，同时造成环境污染，对人畜具有危害，因此杀虫特异性好、环境友好、对人畜安全的生物杀虫剂越来越受到人们的重视。苏云金芽孢杆菌对鳞翅目害虫的防治是最成功、最广泛的生物防治典型(Microbiology and Molecular Biology Reviews,1998，62(3):775-)，但杀鞘翅目害虫的Bt杀虫剂应用较少，这与杀鞘翅目昆虫的Bt菌株及基因资源较少、杀虫晶体蛋白毒性较低等有关。因此，不断挖掘新的特异性Bt菌种及基因资源，通过基因工程的手段提高杀虫蛋白产量及毒性，构建出对鞘翅目有高效杀虫活性的Bt菌株并运用其生产新型杀虫剂具有现实意义和紧迫性。 

在杀鞘翅目Bt菌株的筛选和基因资源发掘方面，文献“Bacillus thuringiensis var.tenebrionis,a new pathotype effective against larvae of Coleoptera”报道了第一株对鞘翅目害虫有特异杀虫活性的Bt菌株（Zeitschrift Fur Angewandte Entomologie-Journal of Applied Entomology,1983,96(5):500-508）。文献“A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against coleopteran insects”和“Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a coleopteran-active delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis subsp.san diego”报道了第二株对鞘翅目昆虫有毒性的Bt菌株并克隆了其杀虫晶体蛋白编码基因cry3Aa （Bio-Technology,1986，4(4):305-308；Gene,1987，57(1):37-46）。以上两种Bt菌株都对危害严重的马铃薯甲虫有高效的杀虫活性。文献“A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeid beetles”及“Insecticidal spectrum of a novel isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis”报道了对金龟子幼虫蛴螬有活性的Bt菌株，此菌株对多种金龟子幼虫有高效毒杀活性，但对鳞翅目、双翅目、直翅目和鞘翅目（金花甲科）害虫无活性，表现了高度的特异性(Letters in Applied Microbiology,1992，14(2):54-57；Biological Control,1992，2(2):138-142)；此后，文献“Characterization of larvicidal toxin protein from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain Buibui specific for scarabaeid beetles”和“Cloning,heterologous expression,and localization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain Buibui toxic to scarabaeid insects”报道了该菌株的杀虫活性物质为130KD的Cry蛋白，相应的基因为cry8Ca1(Journal of Applied Bacteriology,1994，76(4):307-313；Current Microbiology,1994,28(1):15-19)。三十年来，陆续有不同的对鞘翅目害虫有活性的Bt菌株和基因被分离和克隆。目前，已知的对鞘翅目害虫具有杀虫活性的Bt主要有拟步甲亚种（Bt subsp.tenebrionis）、圣地亚哥亚种（Bt subsp.sandiego）、莫里逊亚种（Bt subsp.morrisoni）、多窝亚种（Bt subsp.tolworthi）、熊本亚种（Bt subsp.kumanotoensis）、库斯塔亚种（Bt subsp.kurstaki）、蜡螟亚种（Bt subsp.galleriae）、苏云金亚种（Bt subsp.thuringiensis）、日本亚种（Bt subsp.japonensis）和中华亚种（Bt subsp.chinensis）等。文献“几个对鞘翅目昆虫有毒性的苏云金杆菌菌株”研究了Bt菌株C-001～006和ES-01对铜绿丽金龟(Anomala corpilenta Motschulsky)、黄粉虫(Tenebrio molitor)的毒性(昆虫知识,1991，(3):151-152)；“杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌新菌株及杀虫剂的研究”和“杀鞘翅目幼虫Bt菌株YM-03的δ-内毒素基因定位”报道了Bt菌株YM-03对马铃薯甲虫和柳蓝叶甲等鞘翅目昆虫的杀虫活性及杀虫基因的定位(微生物学报,1999,39(6):515-520；微生物学杂志,2000,20(1):18-19)，YM-03中的杀虫蛋白基因已被克隆并被正式命名为cry3Aa8(accession number:AY572010)。“一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株”报道了对铜绿丽金龟(Anomala corpilenta Motschulsky)与黄褐丽金龟(Anomala exoleta Faldermann)幼虫有毒杀活性的Bt菌株HBF-1(中国生物防治,2000,16(2):74-77)。“苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立”、“苏云金芽孢杆菌cry1Ie1和cry8基因的研究”及“Improving toxicity of Bacillus thuringiensis strain contains the cry8Ca gene specific to Anomala corpulenta larvae”完善了PCR-RFLP鉴定体系，并利用此技术从Bt菌株HBF-1中克隆到了一个与cry8Ca1仅一个密码子（一个氨基酸）差异的杀虫蛋白基因cry8Ca2 (中国农业科学,1998,31(3):11-14；中国农业科学院生物技术研究所博士后研究工作报告,2003,23-46；Current Microbiology,2007，55(6):492-496)。文献“Bt杀虫晶体蛋白的研究概述”总结了杀鞘翅目害虫的杀虫晶体蛋白基因有cry1B,cry1I,cry3A,cry3B,cry3C,cry7A,cry8A,cry8B,cry18A等(黑龙江农业科学,2004,5:37-39)。文献“Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins”总结了杀虫Bt晶体蛋白的杀虫活性，其中30种Cry蛋白（二级分类）对鞘翅目害虫有杀虫活性，除Cry8类蛋白（7种）外，其余种类数目均较少（≤3种），就杀虫谱而言，目前已发现的对鞘翅目害虫有活性的Cry蛋白对多种鞘翅目害虫有活性，其中Cry3Aa类蛋白杀虫谱最广，甚至对半翅目（Hemiptera）和膜翅目（Hymenoptera）害虫都有活性(Journal of Invertebrate Pathology,2009,101(1):1-16)。文献“对鞘翅目昆虫高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选鉴定”总结了不同的鞘翅目毒性Cry蛋白及其杀虫谱(黑龙江大学生命科学学院，2012)。“蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究”（现代商贸工业，2010，9：353-355）及“苏云金芽孢杆菌对松材线虫的杀线活性”（中国生物防治，2010，26(1)：85-89）等分别从众多的苏云金芽孢杆菌菌株中筛选到了对烟草甲、美国白蛾、甜菜夜蛾、蛴螬、线虫等害虫的高效特异性菌株。