[发明专利]一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶催化的底物范围十分广泛，因此漆酶已被广泛应用于造纸工业、纺织工业、食品工业以及土壤的生物修复等领域。

漆酶催化氧化底物一般包括两种作用方式，第一种是底物分子直接与漆酶铜簇反应氧化成相应的激发态分子。然而有些底物不能有漆酶直接氧化，原因在于它们分子太大而不能渗透进入酶的活性部位，或者由于其氧化还原电位较高而不能被漆酶直接氧化。漆酶氧化底物的第二种方式是通过一些小分子的介体物质为媒介，漆酶先将小分子介体氧化成激发态，然后这些激发态的介体再与大分子的或氧化还原电位较高的底物反应，该方式也被成为漆酶—介体系统（LMS）。漆酶—介体系统的应用有助于进一步扩大漆酶的底物范围，提高漆酶的工业应用范围。

在自然界中，漆酶广泛分布于植物、真菌和细菌中，特别是真菌，是目前漆酶的主要生产者。虽然目前对细菌漆酶的理论研究不如真菌漆酶深入，但细菌具有生长快、易于培养的特点，细菌漆酶较真菌漆酶在碱性环境和高温下具有更好的稳定性。由于工业造纸废水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中受到稳定性的限制，因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。

染料被广泛应用于纺织、印染、皮革等行业，全球每年生产染料万种之余，至少有10%–15%的染料通过废水排放到自然环境中，对水体的生态环境造成严重破坏。工业使用的合成染料多是芳香族化合物，结构复杂，难降解。目前染料废水的处理反复主要有物理化学法和生物处理法，物化处理技术费用高，存在二次污染；生物法因其经济环保而成为较好的治理方法。其中漆酶由于具有广泛的底物作用范围，可催化降解多种结构的染料在工业染料废水处理上具有较好地应用前景。已有很多关于应用白腐真菌或其他真菌来源的漆酶脱色染料的研究，但关于细菌漆酶以及细菌漆酶-介体系统在染料脱色方面的研究报道较少。通过研究细菌漆酶对不同合成染料的脱色效果，可以进一步推动细菌漆酶的工业应用。

发明内容

本发明提供一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及利用该菌产芽孢漆酶的方法，该菌株可产芽孢漆酶，所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。

本发明产芽孢漆酶的芽孢杆菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年6月8日，保藏号为CGMCC No.7683；本发明芽孢杆菌CLb革兰氏染色阳性，细胞大小为（1μm～2μm）×（5μm～7μm），具有侧鞭毛和荚膜；在固体LB培养基上37℃培养24h，菌落乳白色、扁平、呈圆形，菌落表面干燥、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落不透明且正反颜色一致。

本发明芽孢杆菌CLb V-P试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，丙二酸盐试验呈阳性。芽孢杆菌CLb可利用麦芽糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇醇、山梨醇、密二糖和乳糖；芽孢杆菌CLb具有明胶液化酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶和尿素酶。

本发明芽孢杆菌CLb可在LB培养基上生长，最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.0。

本发明芽孢杆菌（Bacillus sp.）CLb通过16S rDNA序列比对分析，与芽孢杆菌属（Bacillus）的亲缘关系最为接近，保守区相似性为95%。通过结合菌体形态特征、生长条件确定芽孢杆菌CLb为芽孢杆菌属（Bacillus）的一株新菌株，命名为芽孢杆菌CLb。

本发明芽孢杆菌CLb能够产芽孢漆酶，所产的芽孢漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。在介体乙酰丁香酮的参与下，在pH7.0时对RBBR（雷马素艳蓝R）、活性黑KN-B、靛红和结晶紫6h后的脱色率分别为79.13%、91.83%、94.67%和92.5%。

利用上述芽孢杆菌CLb产芽孢漆酶的方法，按以下步骤进行：

一、将芽孢杆菌CLb划线接种于固体产孢培养基上，37℃倒置培养5d；

二、然后用无菌去离子水将固体产孢培养基上的芽孢冲洗下来，加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶，37℃水浴10min；

三、然后依次用含有10mmol/L EDTA的1mol/L NaCl溶液、0.14mol/L NaCl溶液和质量浓度为0.1%的SDS分别清洗芽孢一遍；

四、再用无菌去离子水清洗芽孢一遍；