[发明专利]基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物传感器及其制备方法和应用，尤其涉及一种酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

苯酚和邻苯二酚等酚类化合物因其具有高毒性和难于降解而污染环境、危害人体健康。苯酚和邻苯二酚在环境中广泛存在，是重要的有机化工原料，在化妆品、染料、制药、农药等行业广泛运用；另外，在生物修复过程中，比如堆肥，含苯氧基的化合物、芳香族化合物降解也会直接或间接的产生此类污染物，随着固体废弃物处置中堆肥技术的应用越来越广泛，研究快速、方便且准确测定苯酚和邻苯二酚含量的检测方法具有重要意义。

目前，苯酚、邻苯二酚等有机污染物的主要测定方法有色谱法、紫外分光法、同步荧光光谱法、分光光度法、导数光度法、流动注射分析法等，但是，这些方法都存在前处理复杂、耗时长、样品基体效应大、分析周期长等缺陷，对工作人员的操作水平要求高、仪器昂贵，且不便携带，不能进行实时检测，很难在中小型企业中推广应用。

生物传感器是基于生物有机成分（如酶、抗体、核酸、细胞、微生物等），对待测物质进行专一的识别，产生的信号经过信号传导器转变为电信号或光信号，进而定量检测出待测物质的一项新技术。运用生物传感器来检测环境中的重金属、病原微生物、有毒有机物时，生物传感器具有特异性强、检测灵敏度高、检测效率高、成本低廉的特点，因此成为了环境保护工作中的一个研究热点。

目前，科研人员正努力提高生物传感器的稳定性、重复性、结构的可靠性以及实用性，其中，利用各种新型材料固定生物敏感元件并保持活性是发展生物传感器的一个重要方向。制作生物酶传感器的关键是如何高效地固定酶，并保持酶的活性，常用的酶固定方法有：吸附固定法、包埋固定法、共价固定法和交联固定法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种制作简单、使用寿命长、酶活性高、检测精度和效率高的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，还相应提供一种成本低廉、操作简单、制作快速的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，使酪氨酸酶的固定具有更好的稳定性和高活性的保持，在此基础上，还提供一种前述酪氨酸酶生物传感器的应用，该应用能够以低成本、简化操作、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性等特点实现对苯酚和邻苯二酚两种物质的高效检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，所述生物传感器包括一玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面沉积有L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳，所述L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳上通过戊二醛固定有酪氨酸酶（戊二醛起交联作用，通过氨基-醛基键作用于酪氨酸酶和L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳上）。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）修饰氮杂化介孔碳：向一玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积L-半胱氨酸溶液（溶剂通常为水），得到L-半胱氨酸修饰电极，晾干备用；将准备好的氮杂化介孔碳悬浮液（以N,N-二甲基甲酰胺作为分散剂）滴加到L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面上，得到L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极；

（2）交联戊二醛：将步骤（1）制得的L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极的检测端于室温下（一般为25℃～35℃）浸入配制好的戊二醛溶液中，得到复合材料修饰电极，晾干备用；

（3）固定酪氨酸酶（tyrosinase）：在步骤（2）得到的复合材料修饰电极的检测端表面滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过戊二醛的交联作用使酪氨酸酶固定于复合材料修饰电极上，得到酪氨酸酶生物传感器。

所述步骤（1）中，所述L-半胱氨酸溶液的浓度优选1.0×10^-3mol/L～1.0×10^-2mol/L；所述氮杂化介孔碳悬浮液的浓度优选1.0mg/mL～3.0mg/mL，所述L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面优选滴加5μL～10μL的氮杂化介孔碳悬浮液。

所述步骤（2）中，所述戊二醛溶液中戊二醛的质量分数优选1%～3%，所述L-半胱氨酸修饰氮杂化介孔碳电极在戊二醛溶液中浸入的时间优选30min～60min。

所述步骤（3）中，所述酪氨酸酶溶液的pH值为4.5～9.2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的浓度为0.05mg/μL～0.1mg/μL。

所述氮杂化介孔碳是采用包括以下步骤的制备方法制得：