[发明专利]迷迭香体胚发生再生体系建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及迷迭香离体培养再生体系建立的方法。具体讲以迷迭香种子成熟胚为外植体，通过体细胞胚胎发生途径建立再生体系的方法。属于植物细胞工程领域。

背景技术

迷迭香(Rosmarinus officinalis)又名艾菊，唇形科迷迭香属常绿灌木。有清凉气味和甜樟脑的气息，还有提高和加强记忆功能。主要含有酚、酸、酮、萜等化合物，是目前公认高效抗氧化植物之一。可用作香料调味品、香水、洗发露原料，在保健饮料、口服液、化妆品等行业有广阔的应用前景。迷迭香原产欧洲及地中海沿岸地区，现以法国、西班牙、意大利、南斯拉夫、突尼斯、摩洛哥等国栽培较多，我国于上世纪80年代引入。迷迭香因种子发育不良，种子萌发率极低，通常采用扦插育苗。目前，国内外对迷迭香组织培养的研究较少，通过体胚发生途径再生体系建立未见报道。

建立高频、稳定的植株再生体系是利用现代生物技术进行品种改良的前提。植株再生体系是外源基因的良好受体，同时也是体细胞融合的基础。深入研究迷迭香体细胞胚的发生还将为迷迭香优良无性系的繁殖和突变体筛选等研究奠定基础，为细胞培养、原生质体培养生物制药提供技术支撑。迷迭香高频、稳定再生体系的建立成为生物技术育种和生物制药的关键。

发明内容

本发明的目的是建立迷迭香的高频再生体系。

本发明是以迷迭香种子成熟胚为外植体进行培养，以此建立迷迭香再生体系的方法。

本发明通过离体培养迷迭香种子成熟胚建立了的再生体系，所获得的再生植株性状均一、稳定、效率高、易于遗传工程操作。

本发明的培养方法包括三个培养阶段：(1)成熟胚切块培养诱导愈伤组织(2)愈伤组织继代培养(3)愈伤组织诱导体细胞胚和胚状体发育成植株，培养基中均含有蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，培养温度18～22℃，光暗周期16h/8h，光强2500～3000勒克斯，相对湿度70％-80％，每培养20d更换一次新鲜培养基。

本发明三个阶段的基本培养基是改良B5培养基(表一)，在第(1)阶段培养中所用激素为0.5-1.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)，1000-1500mg/L水解乳蛋白(LH)，4.0-8.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，在第(2)阶段的培养基中所用激素为0.01-0.05mg/L2，4-D，0.02-1.0mg/L6-BA，在第(3)阶段的培养基中所用激素为0.1-1.0mg/L6-BA、0.1-3mg/L奈乙酸NAA、100-1000mg/L LH、0.1-10.1mg/L赤霉酸(AC)。

本发明优选的方法包括以下步骤(1)成熟胚切块接种于添加4.0-5.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、0.5-2.0mg/L6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)和1200mg/L水解乳蛋白(LH)的培养基上；(2)诱导得到的愈伤组织第一次继代培养于0.4-0.8mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、0.5-1.0mg/L6-苄基氨基腺嘌呤的培养基上；第二次继代培养于0.5-1.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、0.1-0.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤的培养基上；第三次继代培养于0.1-0.4mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、0.5-1.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤的培养基上(3)继代的愈伤组织在400-600mg/L水解乳蛋白(LH)的培养基上，诱导出体细胞胚并发育成植株。

本发明方法的优点在于

1.此方法建立的再生体系，再生频率达到63％，为高频再生体系。

2.此方法建立的再生体系，植株发育正常、稳定，是良好的育种平台。

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例1