[发明专利]悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法

说明书

技术领域    本发明涉及一种悬钩子环斑病毒的引物及检测方法，具体涉及悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法，属分子生物学领域。

背景技术    悬钩子环斑病毒(Raspberry ringspot virus, RpRSV)是线虫传多面体病毒属A亚组的成员，能侵染多数野生和栽培的双子叶和单子叶植物，至少有14个科的双子叶植物对该病毒表现为感病。RpRSV主要侵染悬钩子属植物、草莓、喇叭水仙、葡萄、矮牵牛、樱桃等植物，能侵入植物的花、果实、叶片、根和种子，导致卷叶病、顶端枯死、矮化病、环斑病等病症，田间作物病毒病的发作呈明显的块状。RpRSV主要分布于法国、挪威、奥地利、比利时、也门、加纳、波兰、土耳其、美国、芬兰、德国、希腊、匈牙利、冰岛、荷兰、西班牙、瑞士、英国和前苏联等。

最初植物病毒的检测主要是生物学检测法，但由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制而运用较少。现在应用较多的是血清学方法。RpRSV具有多个血清型突变株和分离物。常规的血清学方法灵敏度较低和特异性较差，容易出现假阳性和假阴性现象，导致出现漏检的现象，需要通过进一步检测加以鉴定。目前国内对RpRSV只有血清学检测，还未见有反转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）特异性检测RpRSV的研究报道。因此，建立快速、灵敏的RpRSV分子生物学检测方法十分重要。

发明内容    本发明的目的是提供悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法，所述RT-PCR，是应用反转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）技术检测悬钩子环斑病毒的方法，是基于对病毒的保守序列分析设计的特异反转录引物的检测方法，在植物病毒检测上具有快速、灵敏、特异性强的特点。

实现上述发明目的的技术方案如下：

本发明的悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物，其特征在于由1对寡核苷酸引物RpRSV-F1和RpRSV-R1组成，序列如下：

RpRSV-F1： 5’-TCAGCGGTACTGTTAAATGTC-3’

RpRSV-R1： 5’-CTAAAGGCACAACCTCAAAGA-3’；

本发明利用悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物，检测悬钩子环斑病毒的RT-PCR方法，包括以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增和RT-PCR产物电泳检测，其特征在于：

（1）RT-PCR扩增：

第一步合成cDNA，在0.5 mL反应管中，加入6 μL总RNA，2 μL 10 μmol/L的下游引物RpRSV-R1，95℃水浴10 min，冰浴5 min，然后继续加入加入4 μL 2.5 mmol/L的dNTPs，5 μL 5× Reaction buffer，0.5 μL 40 U/μL的Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor，0.5 μL 200 U/μL 的M-MLV Reverse transcriptase，7μL灭菌水，混匀后37℃水浴60 min，75℃水浴15 min，合成cDNA；

第二步进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL，包括13.25μL灭菌水，2.5 μL 10× PCR buffer，2 μL dNTPs，2 μL上游引物RpRSV-F1，2μL下游引物RpRSV-R1，3 μL cDNA，0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶，混匀后于PTC-200 PCR仪上进行扩增；反应参数为94℃ 3 min；94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃延伸10 min；

（2）RT-PCR产物电泳检测：

RT-PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果：在222bp处未出现特异性基因条带的样品，表示该样品不含有RpRSV；在222bp处出现基因条带的样品，表示该样品含有RpRSV。