[发明专利]一种四环素菌种选育方法

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵医药技术领域，特别是涉及一种四环素菌种选育方法。

背景技术

四环素具有抗菌谱宽、急性、毒性低、副作用小的优点，虽然在医药方面的直接用量并不大，但它以其抑菌、促生长、饲料利用率高及其在肌体内残留量低等优点，在畜牧业上大量用作饲料添加剂；此外通过化学改造可以制备或者发明具有高的临床价值且疗效更为优越的半合成抗生素，近年来四环类抗生素在抗肿瘤、抑制骨吸收、促进骨形成等方面的研究，拓宽了这类产品在医药方面的应用范围。目前，在我国四环素菌种选育中，其性能的优劣由摇瓶培养发酵液生产抗生素效价的高低来判定。现有技术中四环素筛选自然选育流程如下：选择出发株、制备分离平板培养基、制备单孢子悬浮液、涂布分离培养、挑单菌落接斜面、摇瓶初筛（摇瓶培养、HPLC法检测）、初筛留种、接复筛斜面、摇瓶复筛（摇瓶培养、HPLC法检测）、复筛留种、性状考察和高产菌种复筛留种。上述方法存在着流程繁琐、选育周期长、工作量大、需要专用设备（恒温振荡器）、能耗大、成本高、筛选效率低等缺陷。因此，在实际生产中，本着“初筛以量为主、复筛以质为主”的筛选原则，尽可能地放大初筛数量，使初筛的手段尽可能地快速、简单；但现行工艺从单菌落培养到菌种性能的初筛检测还是需要一定的周期，缓慢又繁琐；并且，在此期间菌种培养恒温室、摇瓶培养恒温振荡器均处于在线使用状态，设备及功能间的利用率低、菌选耗时长，对于四环素菌种选育工作来说，筛选工作依然处于低效率状态。因此，提供一种快速初筛方法对于四环素的生产来说具有非常重要的意义。

尽管抑菌圈测定抗生素效价方法是传统的快速初筛测定法。其原理是：待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制试验菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对试验菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成试验菌不能生长的抑菌圈。方法是：将待检测菌种的单菌落琼脂块移至含有试验菌（多采用短小芽孢杆菌）的琼脂块培养基上，在适宜温湿度下培养一段时间后取出，用游标卡尺来分别测定各抑菌圈的直径，直径大小反映了琼脂块产抗生素能力的大小，以此判断、择优选取。虽然四环素有抑菌活性，其自身能分泌抑制试验菌生长的物质或分泌某种对试验菌有利的物质，但四环素抑菌圈法检测效价时由于自身基内菌丝分泌色素导致测量抑菌圈直径时抑菌圈的分界线不好划分，抑菌圈法检测的效价与摇瓶效价比较误差较大。

发明内容

本发明目的在于提供一种有效缩短四环素菌种选育周期，提高筛选效率，降低筛选成本的菌种选育方法。

本发明采用琼脂块培养初筛流程选育法，过程为：生产菌种斜面培养，制备单孢子悬浮液，涂布分离培养出单菌落，挑取单菌落点种于固体培养基平板上，HPLC法检测产素能力，挑取相应初筛高产菌株斜面摇瓶复筛，复筛摇瓶效价HPLC法检测，高产菌株复筛留种，高产菌株性能考察，最终留种。

上述工艺具体来说为：挑选生产使用的四环素斜面一瓶，制备成单孢子悬浮液，梯度稀释后按一定体积注入分离培养基中，按照菌种工艺培养至4～5天（菌落成型、表面有孢子分泌），用灭菌牙签选取各型单菌落（菌落形态要有记录）点种于点种优化培养基上，点种培养平皿倒置于恒温培养室培养4～5天，培养温度33±1℃；分离平皿倒置于恒温培养室继续培养2天左右，认真观察菌落的生长变化。待分离培养基上单菌落生长成熟，挑取单菌落制备斜面；待点种培养基上单菌落生长成熟，用接种铲铲下单菌落、用适宜溶剂提取后经HPLC做初筛检测；待斜面生长成熟，铲下并用适宜溶剂提取后经HPLC做初筛检测。在试验过程中认真观察各阶段菌株的生长情况、统计HPLC检测结果、分析各数据统计表之间的相关性，得到以下发明效果：本发明可以有效缩短四环素的选育周期、提高筛选效率、节约筛选成本；琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对应。本发明的效果：与传统的四环素摇瓶初筛选育方法相比，本发明可以将筛选周期缩短近10天，并且琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对应。

具体实施方式

1、仪器与材料：

1.1仪器：

漩涡混合器、台式低速离心机、安捷伦高效液相色谱仪。

1.2材料：

出发菌株（挑选生产使用菌株四环素菌），分离（斜面）培养基、点种培养基、种子摇瓶培养基、发酵摇瓶培养基；盐酸（分析纯）、甲醇（分析纯）、无水甲醇（色谱纯），有机滤膜。

1.2.1培养基：

1.2.1.1分离（斜面）培养基（g/L）：