[发明专利]基于一维长柱液相色谱串联质谱的蛋白质组分离鉴定方法

权利要求书

1.基于一维长柱液相色谱串联质谱的蛋白质组分离鉴定方法，其特征在于，包括步骤：

(1)裂解液从细胞或组织中提取全部蛋白质混合物；

(2)蛋白质经沉淀，重悬，进行还原烷基化；

(3)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶解成肽段混合物；

(4)将酶解获得的肽段混合物进行一维液相色谱串联质谱鉴定；

所述的液相色谱串联质谱中，色谱柱长度为色谱分离柱长度大于40cm，色谱梯度为三步长梯度洗脱。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的色谱分离柱长度为50cm。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，裂解液包含100mM TrisHCl pH 7.6 ，2%以上SDS和DTT以及蛋白酶抑制剂，溶解产物在80摄氏度以上高温孵育5分钟。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，裂解液包含100mM TrisHCl pH 7.6 包含4%SDS和100mM DTT以及蛋白酶抑制剂。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，采用甲醇-氯仿进行沉淀。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，使用胰蛋白酶、GluC或Lys-c特异性酶中的一种或两种以上蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶解。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，采用Lys-C和Trypsin组合酶解。

8.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，采用50cm反相色谱柱进行鉴定；其中，

反相色谱分离柱填料粒径为1.8-5 μm，填料孔隙率为10nm-50 nm，反相色谱分离柱长度大于40cm,典型的长度为50cm，流速为100-500 nL/min。

9.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三步长梯度洗脱的条件为流动相A为pH 2-5的2%乙腈0.1%FA水溶液，流动相B为pH 2-5的98%乙腈0.1%FA水溶液，在0-30分钟分别采用0－10％B；在30-240分钟分别采用10－20％B的梯度；在240-340分钟分别采用20－35％B的梯度；之后340-345分钟均采用35－80％B剃度、345-355分钟均采用80％B的等度洗脱、355-360分钟均采用80-0％B的梯度；360-400分钟采用0%B对色谱柱进行平衡。