[发明专利]一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种超氧化物歧化酶（SOD）的提取工艺，特别是一种动物血球液中提取超氧化物歧化酶（SOD）的新工艺。

 

背景技术

SOD是一种源于生命体的活性物质，由蛋白质和金属离子组成，机体细胞抵御氧化损伤最重要的关键金属酶，具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗辐射、提高免疫功能、降低血压血脂、预防和辅助治疗糖尿病、预防前列腺炎、预防慢性病及其并发症、化疗副作用的消除剂、避免手术的二次伤害、防治皮肤病和加快创面愈合等功效。SOD具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强人体免疫力等多种功能，现广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等行业，市场前景十分广阔。传统的SOD制备工艺采用丙酮进行沉淀分离，由于丙酮具有毒性，在SOD中会有残留，进入人体后会沉淀积累，对人体损伤较大，因此研究配置一种无毒害作用的有机溶剂对SOD粗酶液进行沉淀从而将SOD分离成为亟待解决的技术。

发明内容

本发明的内容在于克服常规方法提取SOD在工业化生产中工艺复杂、生产设备多、成本高昂的不足，提出一种工艺简捷、成本低廉、操作方便，适合工业化生产的新工艺。

1、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下，一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤，（1）分离血球,取新鲜动物血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜动物血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球；（2）除血红蛋白, 红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后 4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液；（3）热变性, 上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液；（4）沉淀, 清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀;沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的 2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液；（5）SOD的纯化，采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀合用的方法，首先将SOD粗提液先在55℃下处理15min,然后调节pH值至其等电点3~4,最后加入终体积为1.0%的丙酮,收集沉淀。向沉淀中加入去离子水,溶液即为SOD提纯液；采用DEAE Sepha-dexA-50层析柱进行纯化,纯化产物即为SOD精品液。

作为本发明的一种改进，：所述步骤（1）进行抗凝处理时，所使用的柠檬酸钠，添加量为2.0—3.0g/Kg动物血，搅拌溶血时间20-30min。

相对于现有技术，本发明的优点如下，（1）该方法简单、易于操作，降低了生产成本；（2）采用热变性去除血红蛋白，溶血过程能在常温下进行，使操作更简便，降低能耗；（3）在以往的SOD提取中，往往通过添加大量金属盐来保持SOD的活性，但是很容易造成金属离子超标，且得的SOD不纯净；本工艺不添加过渡金属盐，既控制了金属盐离子的超标，又节约了大量的成本；（4）采用热变性—等电点—丙酮分级沉淀合用的方法，既能有效的对SOD进行一定程度的纯化，又极大的压缩了浓缩液的体积，使得丙酮的用量大幅度的减少，操作起来方便快捷，适合大规模工业化生产。

具体实施方式

 为了加深对本发明的理解和认识，下面结合具体实施方式对本发明作出详细的说明和介绍。