[发明专利]重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原及其生产方法、乙肝疫苗及其生产方法

权利要求书

1.一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原的生产方法，该方法包括有用重组酿酒酵母种子培养酵母菌的酵母培养步骤、从所述酵母菌中提取抗原的抗原提取步骤和对所述抗原进行纯化的纯化步骤，所述纯化步骤包括有依次进行的粗纯化步骤和精纯化步骤，其特征在于，在所述抗原提取步骤之后和纯化步骤之前，还包括有：

去曲通步骤，将所述抗原提取步骤提取到的抗原用XAD-4柱循环去除曲通，得到去曲通抗原样液；

所述粗纯化步骤包括：

装柱步骤，将孔径为1000A、颗粒大小为35μm～70μm的大孔硅胶装入层析柱中形成大孔硅胶柱后，用pH值为7.6±0.2的磷酸缓冲液对所述大孔硅胶柱进行平衡处理；

上样步骤，将所述去曲通抗原样液用NaOH调pH值至7.6±0.2后，上样到所述大孔硅胶柱，其中，所述大孔硅胶柱与去曲通抗原样液上样量的体积比为1:1～1:3，上样温度为2～8℃；

后处理步骤，用pH值为7.2±0.2的磷酸缓冲液对上样步骤所得的大孔硅胶柱进行洗杂后，在45～49℃温度下用pH值为8.7±0.2的硼酸缓冲液对洗杂后的大孔硅胶柱进行洗脱处理并收集洗脱液，对所述洗脱液进行超滤浓缩处理，得到澄清抗原。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱处理包括：

将洗杂后的大孔硅胶柱的温度从2～8℃上升到45～49℃，上升时间控制在1.5小时以内；

在45～49℃温度下用pH值为8.7±0.2的硼酸缓冲液对洗杂后的大孔硅胶柱进行洗脱处理并收集洗脱液，洗脱处理时洗脱线速度不超过80厘米/小时，洗脱液的pH值控制在7～9；

将洗脱液降温至2～8℃，再进行超滤浓缩处理。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原提取步骤之中还包括：

蛋白酶抑制步骤，在所述抗原提取步骤提取到的抗原中加入蛋白酶抑制剂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精纯化步骤具体包括：

将所述澄清抗原依次经过丁基琼脂糖疏水层析，硫氰酸盐转型处理，并用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为20～81ug/ml，除菌过滤后，得到HBsAg原液。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酵母培养步骤包括：

将表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种依次经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌；

所述抗原提取步骤包括：经高压匀浆器破碎酵母菌，滤膜过滤除去酵母菌碎片，得到抗原。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种为美国默克公司生产的以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种。

7.一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原，其特征在于：该乙肝表面抗原采用如权利要求1-6中任一项所述的方法生产制得。

8.一种乙肝疫苗，其特征在于：该乙肝疫苗的活性成分包括有如权利要求7所述的重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原。

9.一种乙肝疫苗的生产方法，其特征在于，该方法包括如权利要求1-6中任一项所述的重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原的生产方法。