[发明专利]构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域和干细胞领域，具体地说，涉及一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞（ES细胞，embryonic stem cells）是由早期胚胎内细胞团细胞（ICM细胞，Inner cell Mass）或原始生殖细胞（PGC细胞，Primordial germ cells）经体外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞,其具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。在体外抑制分化培养条件下可以对其进行各种遗传操作，通过胚胎嵌合和细胞核移植参与各种组织的发育，形成克隆动物。通过对体外ES的操作，除了克隆动物之外，ES细胞在生产转基因动物，药物筛选甚至在人类疾病治疗上都有不可比拟的用处。2006年，日本Yamanaka率先利用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个转录因子实现成纤维细胞向干细胞的转变。诱导多能干细胞（iPS细胞，induced pluripotent stem cells）具有和ES一样的干细胞特性。周琪课题组于2009年成功利用四倍体补偿技术证明了iPS细胞的全能性。

尽管应用前景广阔，但是ES细胞和iPS细胞的培养条件也相对苛刻。一方面要保证不断增殖，同时又要求不能分化。目前为止，无论是ES细胞系还在近年来兴起的iPS细胞，在体外培养过程中饲养层细胞和小分子例如白血病抑制因子（LIF，leukemia inhibitory factor）、成纤维细胞生长因子（FGF，Fibroblast growth factors）发挥了举足轻重的作用。

有关饲养层的不断探索发现，不同的饲养层在维持干细胞特性上存在差异，而且，MEF（小鼠胚胎成纤维细胞，Mouse Embryonic Fibroblast）作为国际上公认的最常用的饲养层细胞也有自身无法回避的缺点，例如，生命期有限，不能在体外长期传代，而且其产生促生长因子和抑制分化因子的能力也会随着传代时间的延长而逐渐减弱甚至丧失。再如，在人ES细胞培养过程中可能造成的交叉污染问题。无饲养层的培养体系虽然也有报道，但其对维持干细胞生长的稳定性还有待研究。

LIF是在干细胞培养中最常用的添加物。在干细胞体外培养过程中发挥着至关重要的作用。但是，LIF价格不菲。而且有相关的研究表明，小鼠和大鼠的LIF在序列上的同源性高达90%，但是，在大鼠ES的培养中发现，大鼠LIF要优于小鼠LIF。也就是说尽管不同物种的LIF同源性很高，但是差异依然存在。目前已经商品化的LIF仅有鼠源、人源和大鼠的，远远不能满足不同物种的需求。

基于上述原因，亟待建立一种能快速建立高效表达细胞因子饲养层细胞的方法。该方法使得饲养层和细胞因子都不再受物种来源的限制。一方面在研究中可用于优化体外培养体系，也可以建立同时表达多个细胞因子的饲养层细胞。另外，在实际应用中降低实验成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速构建能高效分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种构建能分泌表达细胞因子的转基因饲养层细胞的方法，其是将编码至少一种特定细胞因子的基因整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。

前述方法中，所述特定细胞因子包含白血病抑制因子（LIF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等。其中，LIF来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、猪、人等。

前述方法中，所述哺乳动物饲养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、猪胚胎成纤维细胞等。

前述方法中，将含有编码至少一种特定细胞因子的基因的质粒转化（优选电转化）到哺乳动物的饲养层细胞中，获得的转基因饲养层细胞可分泌表达特定细胞因子。

前述方法中，构建含有编码至少一种特定细胞因子的基因的表达载体，将构建的表达载体通过PB（PiggyBac）转座系统整合至哺乳动物饲养层细胞的基因组中，随饲养层细胞进行分泌表达。

前述方法中，所述表达载体中含有启动子EF-1α（Human elongation factor-1 alpha)或CAG（巨细胞病毒CMV的增强子和鸡β-actin启动子的组合体）。

前述方法中，所述表达载体中还含有药物筛选标记，如新霉素（neomycin)的抗药基因Neo等。