[发明专利]一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程制备活性肽领域，公开一种抗肿瘤融合蛋白疫苗VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽及肽的融合表达工程菌的构建、DEAE52离子交换层析制备VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽的方法及体外Western blotting鉴定融合蛋白疫苗的正确表达及所含两种抗原表位的免疫原性。

背景技术

生物治疗是一个广泛的概念，涉及一切应用生物大分子进行治疗的方法，种类十分繁多.如果从操作模式上来分非细胞治疗和细胞治疗。生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类癌症治疗方法，系利用和激发机体的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。生物治疗的主要优点有：运用正常人赖以生存而肿瘤患者表达较低的生物细胞因子调动机体自身的免疫力量达到抗肿瘤作用，与放疗和化疗相比，副作用很小；通过主动免疫能够激发全身性的抗肿瘤效应，作用范围更加广泛，特别适用于多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤；采用分子靶向药物进行治疗，目标明确，对肿瘤细胞以外的正常细胞无影响，对不宜进行手术的中晚期肿瘤患者，能够明显遏制肿瘤的进展，延长患者生命。

肿瘤多肽疫苗即属于一种重要的非细胞生物治疗模式，因制作工序简单、费用低廉、化学性质稳定、无致癌性等优点而成为肿瘤免疫治疗的新方法。理想的多肽疫苗免疫原性强，能激活抗原特异性CTL和HTL反应，有效杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒害作用。但是普通的多肽抗原因其表位单一、分子量小易降解等原因而致免疫原性弱，只能激发低水平的CTL反应，不能获得理想的抗肿瘤效果，故在多肽疫苗设计过程中需重点解决提高免疫原性的问题。

分子靶向治疗针对肿瘤异常的信号通路，具有高选择性、低毒性和高治疗指数，可长期用药，从而有可能使恶性肿瘤转化为“慢性病”。目前，已有十余种分子靶向药物被批准用于实体瘤治疗，另有数十种处于临床研究中。分子靶向药物已经成为抗肿瘤新药研发的主要方向。但是，单一靶点的小分子类药物治疗范围窄，且易产生免疫逃逸和耐药性。大多数实体肿瘤都是多靶点、多环节的调控过程，阻断一个受体或靶位不一定能阻断所有细胞信号转导。多靶点药物简化了治疗程序，代表了肿瘤靶向治疗药物新的发展方向。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的血管新生因子，是促进血管生长作用最强的关键因子之一，是诱导血管生成的主要调节因素。而血管的生成是肿瘤快速生长和恶变转移所必须的条件。目前共发现有五种哺乳动物VEGF配体和三种VEGF酪氨酸激酶受体，一些共受体还可间接的调节VEGF的生物学效应。VEGF在正常组织和肿瘤组织中的表达有显著差异，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，为肿瘤的治疗提供了新的作用靶点。

人绒毛膜促性腺激素(hCG)在肿瘤细胞表面的异位表达是肿瘤细胞的特征性标志之一，正常情况下成人组织细胞的胚胎基因处于静息状态，不表达或仅表达极其微量的hCG，当细胞发生恶性转化时，静息的胚胎基因被激活而表达。但良性肿瘤细胞一般不表达异位hCG，分化程度越低的肿瘤表达越高，恶性程度也越高；而且对肿瘤生长、和逃避免疫系统攻击起重要作用。hCG并不诱发肿瘤的发生，但肿瘤一旦形成就会表达异位hCG，模拟胚胎发育模式促进自身生长。hCGβ亚基C末端37个氨基酸(βhCG-CTP37)部位浓集了ehCGβ所含6条糖链中的4条(在C末端上第121，127，132，138丝氨酸上连有四条O-糖链)，可能与肿瘤的转移、免疫耐受等特性的关系更密切；而且存在βhCG的特异性表位，可诱导特异性的免疫应答避免交叉反应的发生。所以针对βhCG-CTP37关键抗原的免疫应答(包括抗体和效应细胞)可能对ehCG+肿瘤更具有抗瘤效应。

由于VEGF和hCG均为自体蛋白，极易产生免疫耐受，免疫原性较低，故可通过串联重复表位的方法增强二者的免疫原性。M是热休克蛋白Hsp70上407-426之间的肽段，M2则是两段M的串联重复连接，M2可作为分子内佐剂，增强多肽疫苗的免疫原性，且不依赖Hsp70而发挥作用。X是hCGβ亚基上109-118之间的肽段，通过基于同尾酶技术的基因片段重复技术，构建出十段重复的X10，用于增强βhCG-CTP37的免疫原性。

本融合蛋白即为多靶点抗肿瘤多肽疫苗，针对不同的抗原表位，诱发特异性免疫反应，并依赖于M2和X10的帮助，产生高滴度的抗VEGF抗体和抗βhCG抗体，两种抗体分别作用于不同的抗肿瘤靶点，达到抑制肿瘤血管生成和特异性抑制肿瘤细胞增殖的作用。

发明内容

公开一种抗肿瘤双功能融合蛋白疫苗VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽制备方法和应用。