[发明专利]一种特异性水解亚麻籽木酯素的葡萄糖苷酶的制备及应用

说明书

技术领域

本发明设计发酵工业应用及医药前体制备领域。

背景技术

近年来，木酯素作为植物雌激素，因其具有抗氧化、抗癌、抗衰老及抗更年期综合症等功能，而引起大家的广泛关注。植物界中，亚麻籽木酯素含量最丰富，主要有异落叶松树脂酚二糖苷(SDG)、罗汉松树脂酚苷(MAS)等。这些物质要进入体内需要转换成肠二醇(END)、肠内酯(ENL)才能发挥作用。目前主要以END、ENL的前体物开环异落叶松树脂酚(SECO)和罗汉松树脂酚(MAT)作为药物和保健药物应用。而这些前体物的生产主要采用工业化的方法提取SDG和MAS，然后酸水解得到。该法成本高、污染严重，因此开展微生物酶法水解获得END、ENL前体物具有重要意义。

发明内容

SDG在葡糖糖苷水解酶的作用下脱糖基生成SECO；MAS脱糖基生成MAT。此过程由体内益生菌群完成，因此我们通过培养体内益生菌群，利用分子生物学技术获得了糖苷水解酶的基因序列，并转化到工程菌中获得大量表达重组酶的菌株。活性测定表明该菌能够快速水解SDG、MAS生成SECO和MAT，达到了应用价值。同时提取和纯化的重组酶，可以进行工业生产具有重大的经济效益。

附图说明

实验例1 β-葡萄糖苷酶的基因及蛋白氨基酸序列获取

1.1大鼠肠道微生物基因组文库构建

采集大鼠肠道新鲜内含物分离肠道微生物细胞悬浮液，通过低熔点琼脂糖包埋裂解制备基因组DNA，获得的DNA用Hind III进行酶切，回收50～150kb的DNA片段，并与BAC载体连接，构建大鼠肠道微生物基因组文库。

1.2 β-葡萄糖苷酶阳性克隆的筛选

将构建好的文库复制到含有0.1％七叶苷和0.2％柠檬酸铁铵的LB固体平板上，37℃倒置培养20hr，菌落周围显黑色的初步确定为阳性克隆。

1.3SDG特异性β-葡萄糖苷酶阳性克隆筛选及全基因测序

阳性克隆质粒通过Sau3A I酶切，回收2～5kb片段，并与pUC19DNA/BamH I载体连接，转化至E.coli DH5α。重新涂布SDG筛选平板，菌落周围显黑色的再用DNS显色法筛选后确定为SDG特异性β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆。得到的阳性克隆全基因测序，得到SDG特异性β-葡萄糖苷酶核酸(命名为DG β2012)序列如下：

ATGAAGGACCTGACCCTGGAGGAGAAGGCCAGCCTGACCAGCGGCGGCGACGCCTGGCACCTGCAGGGCGTGGAGAGCAAGGGCATCCCCG

GCTACATGATCACCGACGGCCCCCACGGCCTGAGGAAGAGCCTGGCCAGCAGCGCCGGCGAGACCGACCTGGACGACAGCGTGCCCGCCAC

CTGCTTCCCCCCCGCCGCCGGCCTGAGCAGCAGCTGGAACCCCGAGCTGATCCACAAGGTGGGCGAGGCCATGGCCGAGGAGTGCATCCAG

GAGAAGGTGGCCGTGATCCTGGGCCCCGGCGTGAACATCAAGAGGAACCCCCTGGGCGGCAGGTGCTTCGAGTACTGGAGCGAGGACCCCT

ACCTGGCCGGCCACGAGGCCATCGGCATCGTGGAGGGCGTGCAGAGCAAGGGCGTGGGCACCAGCCTGAAGCACTTCGCCGCCAACAACCA

GGAGACCGACAGGCTGAGGGTGGACGCCAGGATCAGCCCCAGGGCCCTGAGGGAGATCTACTTCCCCGCCTTCGAGCACATCGTGAAGAAG

GCCCAGCCCTGGACCATCATGTGCAGCTACAACAGGATCAACGGCGTGCACAGCGCCCAGAACCACTGGCTGCTGATCGACGTGCTGAGGG

ACGAGTGGGGCTTCGACGGCATCGTGATGAGCGACTGGGGCGCCGACCACGACAGGGGCGCCAGCCTGAACGCCGGCCTGAACCTGGAGAT

GCCCCCCAGCTACACCGACGACCAGATCGTGTACGCCGTGAGGGACGGCCTGATCACCCCCGCCCAGCTGGACAGGATGGCCCAGGGCATG