[发明专利]一种表面活性蛋白D纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种表面活性蛋白D（SP-D）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）是由肺泡II型细胞合成并分泌一种复杂的脂蛋白，由磷脂和蛋白质组成的一种具有表面活性的复合物，其中90%为磷脂，8%-9%为表面活性蛋白（Surfactant protein，SP），SP主要包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D，其中SP-B和SP-C为疏水性小分子蛋白，SP-A和SP-D为亲水性大分子蛋白，前两者可降低肺泡表面张力，后两者则主要调节肺免疫功能。SP-D首先是在呼吸系统中发现的，是一种分子量为43KD的糖蛋白，研究表明SP-D作为免疫活性物质可增强呼吸道的抵抗能力、防御微生物和灰尘的侵袭，不但能特异性地直接与矽尘结合，而且还能增强肺巨噬细胞对矽尘的吞噬作用，当矽尘进入肺组织后，肺组织SP-D的表达水平会增高。

间质性肺疾病（ILD）是一种以肺泡壁和肺泡腔具有不同形式和程度的炎症和纤维化为特征性病理改变，以进行性呼吸困难和X线胸片呈广泛分布的浸润影为主要临床表现的弥漫性肺疾病的总称。目前判断ILD主要依靠影像学检查、组织活检、血常规、酶联免疫血清学检测等手段，研究显示有10%的ILD患者X线检查正常，但病理证实为ILD，此时患者在X线不能检出的情况下血清SP-D水平已大幅升高；组织活检由于所取病理位置不同也可能造成漏检。

酶联免疫测定法具备操作简单、价格低廉，精密度高，特异性好，准确性良好，是一种较好的微量物质检测技术，但敏感性相对较低，板间差异大，测值重复性较差，所用标记酶与底物可定量测定范围窄，及仪器测定范围窄等缺点。

化学发光免疫测定研究起步于80年代初，快速发展应用于90年代，为当今最为敏感的微量免疫测定法。

发明内容

本发明要解决的问题是提供表面活性蛋白的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了测值重复性差，酶联免疫法灵敏度低，检测范围窄等缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：表面活性蛋白D（SP-D）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：表面活性蛋白D校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的表面活性蛋白D抗体；表面活性蛋白D抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；表面活性蛋白D质控品，质控品包括浓度3ng/mL的低值质控品和600ng/mL的高值质控品；化学发光液A液和B液，A液为5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.165g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）表面活性蛋白D校准品的配制：

将表面活性蛋白D纯品用校准品稀释液稀释至各浓度点位0，2，10，50，200，1000ng/mL；

所述校准品稀释液为含30%牛血清的缓冲液；

（2）表面活性蛋白D质控品的配制：

用校准品稀释液将表面活性蛋白D纯品稀释至3ng/mL和600ng/mL，3ng/mL作为低值质控品，600ng/mL作为高值质控品；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气氛下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联