[发明专利]一种具备钙通道抑制功能的动物活性肽的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具备哺乳动物N-型钙通道抑制功能的活性多肽─蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的鉴定方法。

背景技术

钙离子作为细胞内重要的第二信使， 对于信号传导、兴奋－收缩藕联、分泌、突触传递、基因表达调控具有非常重要的作用。电压门控钙通道广泛存在于机体的不同类型组织细胞中，参与神经、肌肉、分泌、生殖等系统的生理过程。根据电压门控钙通道的电生理和药理学特征，可将电压门控钙通道分为低阈值(LVA)和高阈值(HVA)两大类。其中低阈值钙通道主要包括T-型钙通道，高阈值钙通道主要包括有N-型、L-型、P/Q-型和R-型四类。其中N-型钙通道仅发现存在于神经组织中，主要触发递质的释放，与疼痛的传递密切相关。蜘蛛产生各种作用于神经系统的神经毒素，其神经毒素根据它们的化学结构分为蛋白多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。其中蜘蛛多肽神经毒素最重要，蜘蛛多肽类神经毒素根据它们的功能和分子特征可分为两种类型:第一种是低分子量多肽类，它们能与兴奋性细胞膜上的阳离子通道相互作用；第二种是高分子量多肽类，它们与突触前膜的受体组分及增强神经介质的分泌作用密切相关。蜘蛛毒液已成为神经毒素的一个重要新来源，而且蜘蛛毒液中特异性药物和毒素分子也是我们寻找农业杀虫剂的较好模式分子。

SPAP-XVI的分子量约为4437.4 Da，经序列测定，该多肽的一级结构由39个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。

发明内容

本发明旨在于提供一种从蜘蛛毒液中鉴定哺乳动物N-型钙通道抑制剂蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的方法。其特征在于：

（1）大鼠输精管实验研究SPAP-XVI 的组织水平生物学活性：大鼠处死后立即取出长约2厘米的输精管，并置于预先用95% O₂/5% CO₂ 饱和的克氏液，轻柔的挤出输精管的内容物。将输精管的两端分别与34oC恒温的浴槽的底部和换能器相连接，立即将标本置于浴槽中，通过分布于浴槽两端的电极向输精管施加脉冲电场刺激 （波宽: 0.14 ms，强度： 100 V，周期：15 s）诱导输精管收缩；平衡30 min 后进行SPAP-XVI的药理学试验；

（2）膜片钳电生理活性实验检测SPAP-XVI对电压门控钙通道的影响：

①急性分离和原代培养大鼠背根神经节细胞用于膜片钳电生理活性实验；SD大白鼠处死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量细胞培养液的烧杯中；用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交汇处的背根神经纤维。在胸腰椎段，可挑选16个左右并置入盛有2 mL培养液的培养皿中；在解剖显微镜下，用维娜斯剪和尖头镊子分离出神经节。剥离包在节外的絮状物和轴索后，放入盛有约0.5 mL培养液的培养皿中。用吸管吸去液体，将分离好的所有神经节剪碎。剪碎之后，转入消化液，在34℃、震荡频率110 rpm的环境中进行酶解消化反应20 min；期间每隔10 min取出用移液枪吸打数次；向消化液中加入酶的抑制剂，终止酶解处理过程；无菌操作将消化得到的细胞液转入离心管中进行离心（800 rpm、5 min），去上清，加入8 mL含10%小牛血清的长期培养液； 重悬细胞后分成3～4皿，放入培养箱（5%CO₂、95%空气）中，37℃培养3～4 h贴壁；

②膜片钳电生理活性实验：膜片钳实验要在室温条件下进行，采用全细胞膜片钳技术。挑选质膜光滑可见、胞质均匀的DRG细胞作为实验细胞；电流记录通过全细胞膜片钳技术利用放大器EPC9在电脑上进行。玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管。玻璃电极两步拉制而成，经抛光仪抛光后电极尖端直径约为3 mm，充灌电极液后电极电阻为1-3MΩ；实验细胞形成全细胞记录模式后稳定4～6 min；记录电流经EPC-9放大器10 kHz 滤波过滤。线性漏电流和电容电流用p/4程序予以删除, 数据和图形用pulsefit + pulse 8.0 软件采集分析；实验结果用Sigmaplot9.0软件进行分析。

本发明所述的SPAP-XVI的化学结构式如图1所示，其中C为半胱氨酸，I为异亮氨酸，G为甘氨酸，E为谷氨酸，V为缬氨酸，P为脯氨酸，D为天冬氨酸，N为天冬酰胺，R为精氨酸，S为丝氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，H为组氨酸，W为色氨酸，Y为酪氨酸。

附图说明

图1是蜘蛛抑痛肽-XVI的化学结构。