[发明专利]猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种试剂盒，该试剂盒包括一个扩增试剂、一个初筛探针试剂和4个复筛探针试剂；

其中，所述扩增试剂中包括3个引物对：

第一对引物对由SEQ ID NO:1所示的引物和SEQ ID NO:2所示的引物组成，

第二对引物对由SEQ ID NO:3所示的引物和SEQ ID NO:4所示的引物组成，

第三对引物对由SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的引物组成，

其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针，所述5个初筛探针的序列分别为SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:11所示的探针；

其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对：

第一对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:13所示的探针组成，

第二对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:14所示的探针组成，

第三对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:15所示的探针组成，

第四对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:16所示的探针组成，

其中，SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:16的5’末端标记有生物素分子，SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:12的5’末端标记有地高辛分子。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有NASBA反应试剂、核酸杂交试剂、检测试剂、显色反应试剂和终止显色反应的试剂中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述NASBA反应试剂包括；扩增反应液管、酶液管、阳性对照管、阴性对照管和空白对照管；所述核酸杂交试剂包括SSPE杂交缓冲液，所述检测试剂包括抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体；所述显色反应试剂为对硝基磷酸苯的二乙醇胺溶液；所述能终止显色反应的试剂为氢氧化钠溶液。

4.一种检测猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的方法，该方法包括以下步骤：

（1）在dNTP、NTP、T7RNA聚合酶、AMV、RNaseH和NASBA缓冲液存在下，使扩增试剂与待测核酸样本在NASBA反应条件下进行第一接触，得到第一接触后的产物；

（2）将第一接触后的产物与初筛探针试剂在杂交条件下在SSPE杂交缓冲液中进行第二接触，得到第二接触后的产物；所述初筛检测探针能够与所述单链RNA扩增产物的单链RNA杂交；

（3）将第二接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进行第三接触，获得第三接触后产物；

（4）将第三接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终止显色反应试剂进行第四接触和第五接触，得到第五接触后的产物；

（5）测定第五接触后的产物在405nm处的光密度值x，并判断该光密度值是否大于等于临界值a，其中，临界值a的计算方法为：按照步骤（1）-（4）所述的方法对不少于10例猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒阴性的样品在405nm处的OD值进行检测，获得各样品的检测值，并根据检测值计算得到检测值的平均值和标准差，根据公式：临界值a=平均值+10×标准差计算，得到临界值a；

（6）选择光密度值x大于等于临界值a的样本的第一接触后产物与所述4个复筛探针试剂在杂交条件下进行第六接触，得到第六接触后产物；所述复筛探针能够与所述扩增产物的单链RNA杂交；

（7）将第六接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进行第七接触，获得第七接触后产物；

（8）将第七接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终止显色反应试剂进行第八接触和第九接触，得到第九接触后的产物；

（9）测定第九接触后的产物在405nm处的光密度值y，并判断该光密度值是否大于临界值a；

（10）当光密度值y大于临界值a时，判定为相应孔中所含有的探针所对应的病毒阳性。