[发明专利]一种CD34+细胞的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域；更具体而言，涉及一种以脐带源间充质干细胞为起始材料生产CD34+细胞的方法。

背景技术

外周动脉病变（peripheral arterial disease，PAD），尤其是下肢动脉病变往往由动脉硬化闭塞症和血栓闭塞性脉管炎导致的肢体动脉狭窄闭塞和糖尿病所引起。PAD主要体现为严重的肢体缺血，尤其是下肢缺血。

目前，临床上对于远端流出道通畅者，常以介入支架和外科手术治疗。PAD患者常表现为两种情况：

（1）管腔狭窄早期：主要表现为以行走时出现疼痛为特征的间歇性跛行；

（2）随着狭窄的加重，可出现静息痛，甚至丧失行走能力和伴随组织坏死与溃疡发生为特点的危重肢体缺血（critical limb ischaemia,CLI）。

CLI的预后极差，5年生存率仅为50%或更低。CLI的治疗不仅仅是缓解症状、改善受累肢体的功能和防止截肢，还要防止全身动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的进展，以预防心脑血管事件发生。目前主要的治疗手段为：控制高血糖、高血压、血脂异常；去除危险因素，如吸烟；强制性运动锻炼；抗血小板药物和扩血管药物；以及循环重建手术，如外科手术（如旁路移植术或动脉内膜切除术）、血管内介入技术（如支架置入或球囊扩张术）。

经过上述治疗后，约40%的CLI患者仍不能改善预后。对于这部分患者来说，截肢目前被认为是挽救生命所做出的最后治疗选择。但截肢后的总死亡率大约为25%-50%；截肢术围手术期的死亡率为5%-20%；二次截肢率大约为30%。到目前为止，CLI的治疗选择仍然有限，大约40%的患者不符合进行循环重建的指征，或进行循环重建不能得到有益的反应。对于这些“没有其它治疗选择”的患者，药物治疗对延缓病情进展和预防截肢的作用十分有限。

因此，探索缺血肢体血液循环重建的新治疗策略对于减少患者截肢和提高患者生活质量具有非常重要的临床意义。这促使研究者将研究重点转向寻求具有分化潜能的干细胞移植治疗PAD，研究者们希望在病变局部能够使干细胞被诱导为血管上皮细胞来修复损坏的血管。

基础研究发现，能分化为血管内皮细胞的干细胞类型有血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPCs）、骨髓源性单核细胞（bone marrow mononuclear cell,BMMNC）和外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMNC）。但这些干细胞受组织来源的限制，提取和扩增的数量有限。致使这种疗法目前尚处于临床前研究阶段。

实验证明，人CD34+细胞（CD34是成熟血管的标志物）可以缓解CLI的症状、改善受累肢体的功能和防止截肢。但由于其在脐带沃尔通氏胶（Wharton's jelly）中含量仅为5%-10%左右，因此，如何高效地生产该细胞就成为其能否获得广泛应用的重要前提。

截至目前，对脐带血中CD34+细胞的分离通常采取Ficoll分离法、羟乙基淀粉分离法和明胶自然沉降分离法，并在随后用免疫磁珠吸附法（MACS）进一步纯化所获得的CD34+细胞以获得符合要求的CD34+细胞。上述方法直接从人脐带血中分离并纯化原代CD34+细胞，鉴于人脐带血的供应量有限，利用上述方法所能获取的CD34+细胞的数量也极其有限。

因此，本领域仍然需要一种能够以相对简便的方法从人脐带生产大量CD34+细胞的方法。

发明内容

本发明的一方面，提供一种CD34+细胞的生产方法，其包括步骤：

（a）提供脐带来源的间充质干细胞；

（b）对间充质干细胞进行原代培养；

（c）对间充质干细胞进行传代培养；

（d）在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；

（e）获得CD34+细胞。

本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式来提供脐带来源的间充质干细胞。例如，在一些实施方式中，将脐带组织进行酶解之后得到脐带来源的间充质干细胞。

本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式和任何适合的培养基对间充质干细胞进行原代培养。在一些实施方式中，采用贴壁的培养方式对间充质干细胞进行原代培养。在一些实施方式中，在补充有胎牛血清的RPMI1640培养液中对间充质干细胞进行原代培养。经原代培养的间充质干细胞称为P1代。在本发明的上下文中，原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行的首次培养。