[发明专利]大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标及其PCR 引物组合物和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标及其PCR引物组合物和应用。 

背景技术

大豆拟茎点种腐病菌（PhomopsislongicollaHobbs）侵染大豆，引起大豆根腐以及苗期病害，并且可以导致大豆种子品质降低^[1,2]，。大豆拟茎点种腐病菌最早在1976年在美国发现，此后，加拿大、阿根廷、韩国、意大利、南斯拉夫都有报道过^[3,4]。据统计，在1994年，全世界因为该病害导致大豆产量损失高达18.6万吨^[5,6,7]。因其近年来在国外发生普遍、经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道,被有关专家列为大豆上包括大豆疫霉在内的7种危险性真菌病害之一^[8]。为了阻止大豆拟茎点种腐病菌传播范围的不断扩大，使大豆拟茎点种腐病菌病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。 

基于PCR的方法检测病原菌的方法已经成功用于我国的各个进出口口岸，但是以往的靶标选择都是基于核糖体基因序列，但由于核糖体序列没有足够多的位点来区分所有的病原菌，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α。 

本发明的另一目的是提供该大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α的其特异性普通PCR引物组合物。 

本发明的又一目的是提供该大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α及其普通PCR引物组合物的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述的大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1在检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌中的应用。 

针对所述的大豆拟茎点种腐的检测靶标序列Tef设计的特异性的普通PCR引物组合物， 上游引物FP如SEQ ID NO.2所示，下游引物RP如SEQ ID NO.3所示。 

所述的针对所述的大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α设计的特异性的普通PCR引物组合物在检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌中的应用。 

一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR检测试剂盒，包含所述的特异性的普通PCR引物组合物。 

所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR检测试剂盒，包含：由20mM上游引物FP、20mM下游引物RP、10xPCR反应缓冲液(TAKARA)、25mM MgCl₂(TAKARA)、2.5mMdNTP Mixture(TAKARA)，1.25单位Taq酶(TAKARA)，加入超纯水制成的检测溶液。 

一种检测大豆拟茎点种腐病菌的方法，提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的特异性的普通PCR引物组合物进行普通PCR反应；扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在226bp左右的特异性条带，则证明所检测的病原为大豆拟茎点种腐病菌，无特异性条带则证明不含大豆拟茎点种腐病菌。 

所述的检测大豆拟茎点种腐病菌的方法优选提取待检微生物的DNA，取1μlDNA溶液，加入23μl所述的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行普通PCR反应，普通PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。 

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在大小为226bp左右的特异性条带，则证明存在大豆拟茎点种腐病菌，无条带则表示不含该病菌。 

有益效果： 

本发明提供了一个新的大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α，并分析该靶标序列Tef1-α和其他拟茎点霉属病菌菌在序列上的差异，设计了两条特异性的普通PCR引物，在此基础上建立了检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR反应体系。本发明的检测体系在普通PCR扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆拟茎点种腐病菌，具有优异的种间特异性、种内通用性以及灵敏度，能很好满足目前对大豆拟茎点种腐的现场检测的迫切需要，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。 

附图说明

图1实施例2大豆拟茎点种腐病菌特异性实验凝胶电泳结果图