[发明专利]草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医生物制品技术领域，具体地说，本发明涉及一种草分枝杆菌的培养方法及免疫增强剂的制备。

背景技术

免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质。目前佐剂的品种较多，按其作用的先决条件可分为三类：（1）免疫替代剂，用来代替某些具有免疫增强作用的生物因子的药物；（2）免疫恢复剂，能增强被抑制的免疫功能，但对正常免疫功能作用不大；（3）免疫佐剂，又称非特异性剌激剂。常用的免疫增强剂有卡介苗、短小棒状杆菌、内毒素、免疫核糖核酸、胸腺素、转移因子、双链聚核苷酸、氢氧化铝铝胶佐剂等。

上述佐剂中，有的虽然已经研究成功应用于人类如胸腺素，但是价格较为昂贵，不可能用于动物。目前动物用疫苗所用佐剂如氢氧化铝铝胶佐剂，通过延长疫苗在注射部位的停留时间发挥佐剂效应，还没有直接通过增强动物机体自身的免疫应答能力的佐剂来提高免疫效果，致使动物免疫效果较差，影响了畜禽养殖业的快速健康发展。因此，研发新型的免疫增强剂，改善动物免疫效果，成为畜禽养殖业亟待解决的问题之一。

草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)属于放线菌纲放线菌目分枝杆菌科，是一种非致病性微生物。草分枝杆菌中的分枝杆菌胞壁酰二肽(MDP)具有很强的免疫治疗作用，草分枝杆菌多糖MPS在免疫调节、抑制病毒复制方面有很好效果(周莉婷，赵晶晶等，分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展，药物生物技术，2011.18(2)：176-179)。公开号为CN102764434A的中国发明专利申请，也公开了一种动物用免疫增强剂的制备方法及应用：将草分枝杆菌在37℃通气培养，pH7.0，发酵培养5天后细菌浓度为5×10⁷cfu/mL（发酵培养基为酵母提取粉5g～10g，浓缩麦芽汁5.0g～20g，葡萄糖20g～100g，磷酸氢二铵1.0g～4.0g，磷酸氢二钾0.5g～1.0g，注射用水加至1000mL），再通过灭活、浓缩、提纯、均质等工序制备成一种动物用免疫增强剂。这种培养方法耗时长、菌浓度低。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种草分枝杆菌的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用斜面培养基活化草分枝杆菌；

（2）将活化的草分枝杆菌采用种子培养基进行种子培养，得到种子液；

（3）按照3-6%的接种量（v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中，通气培养48-50h，得到草分枝杆菌的发酵液；

所述斜面培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，琼脂15-20g/L，pH7.3-7.5；

所述种子培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，甘油1-5g/L，pH7.3-7.5；

所述发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨5-10g/L，酵母膏5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.4-0.6g/L，氯化钙0.4-0.6g/L，甘油5-10g/L，pH7.3-7.5。

优选地，步骤（1）中，在28-37℃，静置培养72-96h进行活化。

优选地，步骤（2）中，在28-37℃，转速200rpm条件下进行种子培养。

优选地，步骤（3）中，在28-37℃，转速150rpm，通气比为1：0.8-1.2的条件下进行发酵培养。

一种草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法，将上述任一项所述的草分枝杆菌的制备方法制备得到的草分枝杆菌的发酵液灭活，离心收集菌体，用PBS清洗2-3次，计算离心得到的菌体干重，再与适量PBS、0.5-1%SDS混合均匀，进行高压均质破碎，离心超滤即制成免疫增强剂。

优选地，所述草分枝杆菌免疫增强剂的浓度为10-20%。

优选地，向所述草分枝杆菌免疫增强剂中添加0.01%的硫柳汞（v/v）。

一种上述任一项草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法制备的草分枝杆菌免疫增强剂。