[发明专利]细胞培养物得到的α1 蛋白酶抑制剂的纯化

说明书

技术领域

本文描述了用于纯化人类重组细胞培养物得到的α1蛋白酶抑制剂（recA1PI）并且除去与recA1PI蛋白一起共同纯化的带颜色的物质的方法。 

背景技术

α1-蛋白酶抑制剂（本文中缩写为A1P1；也称为α-1蛋白酶抑制剂，α-1PI，A₁PI，α-1PI，α₁PI，α-1胰蛋白酶抑制剂，α1抗胰蛋白酶，α-1抗胰蛋白酶，α1AT，A1A，和A1AT，AAT等等），是人体中主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）。A1PI表达为418个氨基酸蛋白，其中残基1-24是信号肽。该成熟蛋白质，由残基25-418组成，是具有约51kD分子量的单链糖蛋白。参见图1。尽管A1PI并不包含任何二硫键，但该蛋白是高度结构化的，其中80%的氨基酸存在于八个明确定义的α-螺旋和三个大β-折叠中。在Asn70，Asn107，和Asn271（按照在全长蛋白中编号）中发现三个天冬酰胺连接的糖类。这导致多种A1PI同种型，具有在4.0至5.0范围内的等电点。该聚糖单糖包括N-乙酰基葡糖胺，甘露糖，半乳糖，岩藻糖，和唾液酸。 

A1PI的正常血浆浓度在1.3至3.5mg/mL范围内。A1PI的功能是保护细胞避免引起凝血和炎症的蛋白酶作用。A1PI抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、各种形式的弹性蛋白酶、皮肤胶原酶、血管紧张肽原酶、尿激酶、和多形核的淋巴细胞的蛋白酶等。A1PI用作这些蛋白酶的假底物，通过切割残基Met358-Ser359之间的键以形成A1PI-蛋白酶复合物，这些蛋白 酶攻击A1PI分子的反应中心环（残基Gly368-Lys392）。由血液循环快速地除去该复合物。A1PI的一种内源性作用是调节中性白细胞弹性蛋白酶的活性，该酶分解外源蛋白并且伤害肺中存在的天然组织。在缺乏足够量的A1P1的情况下，弹性蛋白酶分解肺组织，随着时间的推移这将导致慢性肺组织损害和肺气肿。 

通常从血浆中纯化A1PI。参见，例如U.S.专利号6,284,874；6,462,180；6,093,804；7,879,800；以及WO1998/000154；WO2002/048176；WO2010/009388。另外，可以从各种来源表达和纯化重组A1PI(recA1PI）。参见，例如，US专利号4,931,373和5,134,119；U.S.专利申请公开号US2004/0124143和US2007/0218535；PCT公开号WO2005/047323和WO2010/127939；以及Archibald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:5178-5182(1990)；Wright et al.,Nat.Biotechnology9:830(1991)。 

在本文中描述了用于表达和纯化人类重组的细胞培养物得到的用于治疗用途的A1PI的方法。纯化后，该A1PI溶液具有黄色或者琥珀色颜色，这可能引起临床医生和/或患者的反对。本文中还描述了减弱该颜色的方法。 

发明内容

本文中所描述的一种实施方式是减弱在包含细胞培养物得到的α1蛋白酶抑制剂（recA1PI）的溶液中大量着色剂的方法，包括使包含recA1PI的溶液与还原剂温育并且将recA1PI与着色剂分离。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸或者DTT。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是半胱氨酸。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度是从约1mM至约100mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是10mM。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂浓度约是1mM。 

在本文中所描述的一些方面中，进行该还原温育步骤持续从约1至约24小时的时间。 

在本文中所描述的一些方面中，在从约2°C至约60°C的温度下进行该还原温育步骤。 

在本文中所描述的一些方面中，该还原剂是10mM的半胱氨酸并且在约室温下进行温育过夜。 

在本文中所描述的一些方面中，将recA1PI与着色剂分离包括色谱法。 

在本文中所描述的一些方面中，该色谱法包括离子交换、疏水作用、凝胶过滤、亲合性、免疫亲和性、或者它们的组合。 

在本文中所描述的一些方面中，该方法包括减少铁浓度。 

在本文中所描述的一些方面中，该铁浓度减少（即，降低）2至100倍。