[发明专利]一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法

权利要求书

1.一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法，包括双抗体夹心ELISA检测方法涉及的试剂盒步骤，其特征在于，首先克隆鹅的FSHα和FSHβ亚基基因的成熟肽编码序列，然后构建FSHα和FSHβ亚基基因的成熟肽编码序列的原核表达载体，表达并纯化His-FSHα和GST-FSHβ融合蛋白，以His-FSHα和GST-FSHβ融合蛋白为抗原分别制备高效价、高特异性的羊抗鹅FSHα多克隆抗体及兔抗鹅FSHβ多克隆抗体；同时将FSHα和FSHβ亚基基因的成熟肽编码序列用CTP编码序列连接，构建成重组鹅FSHβ-CTP-α融合蛋白的真核表达载体，以哺乳动物细胞表达并纯化鹅Fc-FSHβ-CTP-α融合蛋白；

以羊抗鹅FSHα多克隆抗体为检测抗体，以兔抗鹅FSHβ多克隆抗体为捕获抗体，以Fc-FSHβ-CTP-α融合蛋白为标准品，建立检测鹅FSH的双抗体夹心ELISA方法；     所述的鹅的FSHα亚基基因的成熟肽编码序列是序列表中SEQ ID No.1；所述的鹅的FSHβ亚基基因的成熟肽编码序列是序列表中SEQ ID No.2；所述的重组Fc-FSHβ-CTP-α融合蛋白编码序列是序列表中的SEQ ID No.3。

2.根据权利要求1所述的一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述的鹅His-FSHα融合蛋白是应用RT-PCR技术钓取SEQ ID No.1序列，构建鹅pRSET-FSHα重组表达质粒，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，IPTG诱导表达His-FSHα融合蛋白，洗涤包含体后用SDS-PAGE电泳分离并从电泳胶上切下特异蛋白条带纯化鹅His-FSHα融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述的鹅GST-FSHβ融合蛋白是应用RT-PCR技术钓取SEQ ID No.2序列，构建pGEX4T-1/FSHβ重组表达质粒，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，IPTG诱导表达鹅GST-FSHβ融合蛋白，洗涤包含体后用SDS-PAGE电泳分离并从电泳胶上切下特异蛋白条带纯化鹅GST-FSHβ融合蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述的高效价、高特异性的羊抗鹅FSHα多克隆抗体是采用纯化的鹅His-FSHα融合蛋白免疫羊，制备并用免疫亲合层析的方法纯化多克隆抗体，并且利用His亲和柱吸附掉His的抗体。

5.根据权利要求1所述的一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述的高效价、高特异性的兔抗鹅FSHβ多克隆抗体是采用纯化的鹅GST-FSHβ融合蛋白免疫兔，制备并用免疫亲合层析的方法纯化多克隆抗体，并且利用GST亲和柱吸附掉GST的抗体。

6. 根据权利要求1所述的一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述的 Fc-FSHβ-CTP-α融合蛋白标准品是用重叠PCR的方法将SEQ ID No.1序列与 SEQ ID No.2序列用CTP序列相连，构建成完整的SEQ ID No.3序列，然后亚克隆入真核表达载体pR vector中，转染入哺乳动物细胞表达并用亲和层析的方法纯化Fc-FSHβ-CTP-α重组融合蛋白。