[发明专利]一种外源基因可移除的慢病毒受控表达载体系统及应用

说明书

技术领域

本发明涉及携带外源性报告基因的慢病毒表达载体系统，尤其涉及由强力霉素（Dox）调控表达，且携带的外源性报告基因可从宿主染色体移除的慢病毒受控表达载体系统，以及该系统在干细胞活体示踪技术中的应用。属于基因工程技术领域。

背景技术

外源性报告基因的过表达需要一个持续、稳定和高效的基因转移和表达系统。目前，大多数外源基因的表达选用病毒表达载体系统来完成。在各类病毒表达载体系统中：逆转录病毒（Retrovirus）载体通常仅能转染主动分裂（actively dividing）的细胞，而且具有插入突变或复制下一代病毒的能力，存在一定风险；腺病毒载体能确保外源基因的高效表达，但其免疫源性蛋白也有可能得到表达，引起宿主免疫反应，此外，其携带的外源基因并不整合进细胞染色体，因此在分裂的子代细胞中该外源基因的表达量持续下降；而慢病毒载体能稳定地整合到宿主细胞染色体内，能在分裂和非分裂的细胞中持续长期表达，因此，慢病毒载体系统已成为目前应用作为广泛的表达载体之一。

当今，以慢病毒为载体的人类多种疾病（如帕金森病、地中海贫血等）的基因治疗已进入临床试验，随着分子影像学理论和技术的发展，活体示踪技术在干细胞（包括肿瘤细胞）的基础研究及临床应用研究领域中扮演着越来越重要的角色，其通过显像示踪手段能无创伤性动态监测携带标记外源性报告基因慢病毒载体的干细胞在活体内的迁移、分布及生存状态，具有广阔的应用前景。

然而，采用慢病毒载体表达系统不可避免地将外源DNA片段（包括外源整合入干细胞染色体组，但这些整合片段对干细胞的生存、分化及增殖是否会产生不利影响尚不清楚，因此，在慢病毒载体表达系统完成其示踪功能后，将外源性基因完全移除是避免宿主细胞生理功能受扰的最佳选择。

发明内容

针对现有慢病毒表达载体系统存在的上述缺陷，本发明的目的之一是提供一种外源基因可移除的慢病毒受控表达载体系统。该系统包括表达质粒和包装质粒，所述表达质粒包括反应质粒和调节质粒，并分别通过如下方法构建获得：

（1）反应质粒的构建

通过慢病毒载体pSMPUW3’LTR U3区域部分碱基的定点突变引入酶切位点，将loxP序列插入所述pSMPUW3’LTR，得突变质粒；用Tet-on系统反应质粒pTRE-Tight上的顺式作用元件TRE和最简化CMV启动子序列取代所述突变质粒的启动子序列，并将外源性报告基因插入所述突变质粒的多克隆位点MCS位置，得反应质粒；所述外源性报告基因处于所述TRE和最简化CMV启动子控制之下，并由Dox诱导表达。在慢病毒逆转录过程，其3’LTR U3区域将被复制并转移到5’LTR，一旦慢病毒表达载体系统整合入宿主基因组，将5’LTR和3’LTR将各产生一个loxP序列。

（2）调节质粒的构建

先对步骤（1）中定点突变的pSMPUW多克隆位点区进行定点突变引入Asc I酶切位点，以利于下述CMV-rtTA2S-M2序列、内部核糖体进入位点EMCV序列及Cre-ER序列的插入；将Tet-on系统中的CMV-rtTA2S-M2序列、内部核糖体进入位点EMCV序列以及Cre-ER序列顺序连接起来，插入步骤（1）中定点突变的pSMPUW的多克隆位点区域，得调节质粒；所述rtTA2S-M2序列和Cre-ER序列能够在同一条mRNA链上各自独立地进行翻译和表达，生成rtTA2S-M2蛋白及Cre重组酶雌激素受体融合蛋白。

其进一步的技术方案为：

所述包装质粒包括pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pCgpV。

所述突变位点序列为ACCGGT，突变后序列为ACGCGT，引入Mlu I酶切位点。

所述外源性报告基因包括荧光蛋白、激酶、激素或细胞因子受体的表达基因。

4-OH-tamoxifen能诱导所述Cre重组酶雌激素受体融合蛋白与Hsp90解除结合，使Cre重组酶切除所述loxP序列之间的所述外源性报告基因和慢病毒载体序列。

本发明的再一目的是提供上述慢病毒受控表达系统在干细胞示踪技术中的应用。将所述反应质粒和调节质粒分别与所述包装质粒共转染包装细胞，得到反应慢病毒和调节慢病毒；将二者共转染靶干细胞，利用Dox诱导所述外源性报告基因的表达并进行显像示踪，最后利用4-OH-tamoxifen诱导可随时切除所述loxP序列之间的外源性报告基因。

本发明具有以下有益效果：