[发明专利]狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明是关于一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用，具体是指一种狂犬病病毒aG株人二倍体细胞（2BS）适应株、该适应株的制备方法以及该适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用。

背景技术

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒感染所导致的以损害中枢神经系统为主要症状的急性传染病，属人兽共患的自然疫源性疾病，一旦发病，病死率100%，目前尚无特效药物用于治疗，接种狂犬病疫苗是预防狂犬病的有效方法。

在我国，目前上市的狂犬病疫苗主要有三种，分别为Vero传代细胞、原代地鼠肾细胞和原代鸡胚细胞疫苗。

Vero细胞生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的，Vero细胞系是连续的非整倍体细胞。由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（10ng/剂）。

原代地鼠肾细胞生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或经批准的其他地鼠肾细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异；动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一致性；需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖3R原则，原代细胞培养的营养条件要求较高，不能进行生物反应器现代化大规模培养，外源致病微生物污染的风险较大。

而进口鸡胚细胞狂犬病疫苗采用的是狂犬病病毒Flury LEP。SPF鸡蛋成本高，疫苗价格高；鸡蛋过敏者仍须慎重使用；病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高；剂量大，每剂量1ml。

人二倍体细胞来源于人胚肺，为人正常核型细胞，无致癌性，无病毒外源因子和外源动物杂质污染，是疫苗生产的最安全细胞基质。人二倍体细胞狂犬病疫苗于20世纪60年代由美国Wistar研究所Wiktor等人首创，1974年在法国首次获准生产上市，1977年WHO推荐使用，主要由法国、德国生产，仅在美国、欧洲等发达国家以及部分亚洲国家使用，目前已接种150多万人群。人二倍体细胞狂犬病疫苗具有高免疫原性和良好的耐受性，无严重的不良反应，不含外源因子，预防性接种产生高滴度的中和抗体，对暴露后人群的治疗安全有效，被认为是狂犬病疫苗的黄金标准。但目前的人二倍体细胞狂犬病疫苗生产技术仍存在产能不高的问题，且疫苗质量有待更进一步提高。

目前我国还没有人二倍体细胞狂犬病疫苗上市的报道。生产人二倍体细胞狂犬病疫苗首要条件为建立狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。

发明内容

本发明的一个目的即在于提供一种人二倍体细胞适应株，以进一步提供安全、有效、与人类抗原性高度一致的狂犬病疫苗。

本发明研究采用人二倍体细胞株——2BS株，对狂犬病病毒aG株进行传代适应性研究，通过带毒细胞传代与挑斑相结合的方法，挑选出了病毒滴度高、免疫原性好的狂犬病病毒适应毒种，建立了狂犬病病毒aG株在人二倍体细胞2BS上的适应株。本发明将该适应株命名为2aG4-B（B为2BS中的B）。本发明的适应株已于2013年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号：CGMCC No.7307。

根据本发明的具体实施方案，本发明采用的狂犬病病毒为固定毒aG株，来源于武汉生物制品研究所，适应前代次为2aG4。毒种2aG4采用在2BS细胞上传代与挑斑相结合的方法，在传代至第40代时建立了本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。按照《中华人民共和国药典》对该第40代进行毒种检定，免疫原性保护指数为270以上，鉴别试验显示所有的病毒被抗狂犬病血清所中和，中和指数高，无外源病毒污染，无菌检查、支原体检查及病毒外源因子检查均合格。此外，通过病毒RNA序列的测定显示适应前后有16个碱基发生了变化，但未对病毒关键序列造成影响，病毒毒力和抗原性无变异。抗狂犬病病毒单克隆IgG荧光显色显示狂犬病病毒阳性。

根据病毒传代稳定性研究结果显示，第40代至第46代病毒，病毒滴度、免疫原性、鉴别试验及RNA序列等无差别，作为毒种均可以生产人二倍体细胞狂犬病疫苗，因此，第40代至第46代七个代次的病毒均被定义为狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。

本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株具有优异的对细胞的亲和性强、传代稳定、无变异、抗原性好、培养产毒量高等特性，能生产出病毒滴度高、效价高、安全性好的狂犬病疫苗。