[发明专利]鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于PCR试剂盒技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR试剂盒。

背景技术

鸭坦布苏病毒（Duck Tanbusu Virus，DTBSV）是引起产蛋鸭产蛋急剧下降、死亡和小鸭神经症状、死亡的一种病毒性传染病的病原。该病主要侵害处于产蛋期的成鸭，可以使处于产蛋高峰期的母鸭的产蛋率在几天之内降到20%以内甚至为0，也可以引起雏鸭的神经症状和死亡，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。新城疫（Newcastle disease Virus，NDV）是引起鸡等走禽和飞禽呼吸道、消化道和神经系统严重病变的病毒，之前一直被认为对鸭等水禽的致病性不强，但今年来陆续有鸭等水禽感染新城疫病毒后发病的报道，说明病毒已经逐渐适应了水禽的机体，对水禽产生了致病性。产蛋鸭感染新城疫强毒之后，同样会引起产蛋下降，且剖检也会见到卵巢出血充血等病变。目前，鸭坦布苏病毒的检测方法包括间接ELISA和PCR，新城疫病毒的检测方法有HI、PCR等。

PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速简便等特点，已经走进临床诊断实验室并广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于DTBSV和NDV的检测。二重RT-PCR是一种特殊的PCR形式，其突出特点是，一次RT-PCR反应，能同时检测并鉴别出两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、快速方便、低成本、高效率的鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR试剂盒，以实现同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒和新城疫病毒两种病原体。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重PCR引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。

上述鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR引物组在二重RT-PCR扩增方面的应用，二重RT-PCR扩增的退火温度为50℃-60℃。

二重RT-PCR扩增的退火温度为54℃。

鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：A液：引物组和One-Step RT-PCR试剂盒；引物组包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，引物组中各引物的浓度为25μM，各1μL，One Step RT-PCR试剂盒包括2×one-step reaction mix（含4种dNTP、RT反应缓冲液组成和PCR反应缓冲液组成）、TransScript one-step emzyme mix（含反转录酶和PCR Taq酶）和去离子水；B液：鸭坦布苏病毒cDNA和新城疫病毒cDNA，作为阳性对照；C液：去离子水，作为阴性对照。

上述鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重PCR试剂盒在二重RT-PCR扩增方面的应用，二重RT-PCR扩增的退火温度为50℃-60℃。

二重RT-PCR扩增的退火温度为54℃。

针对目前缺乏对鸭坦布苏病毒和新城疫病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了鸭坦布苏病毒和新城疫病毒的二重RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明仅需一次RT-PCR反应就能同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒和新城疫病毒两种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明的待测样品可来自健康动物或死亡动物，可为DNA和/或RNA，最低能同时检出10pg鸭坦布苏病毒RNA、10pg新城疫病毒RNA，这为两种病毒的发病早期提供了准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，具有广阔的应用前景，对鸭养殖业可持续发展有着重要的现实意义。

附图说明

图1是二重RT-PCR的敏感性试验结果电泳图，图中：M为分子量标准100bp DNA ladder；1为10ng DTBSV和10ng NDV；2为1ng DTBSV和1ng NDV；3为100pg DTBSV和100pg NDV；4为10pg DTBSV和10pg NDV；5为1pg DTBSV和1pg NDV；6为100fg DTBSV和100fg NDV；7为10fg DTBSV和10fg NDV；8为1fg DTBSV和1fg NDV；9为阴性对照（水）。