[发明专利]一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法

权利要求书

1.一种利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，包括定向肽库的设计、定向肽库的合成构建、目标蛋白的体外表达纯化、定向肽库与目标蛋白的反应、定向肽库的肽段洗脱分离、定向肽库的肽段线性化、线性化肽段的鉴定测序步骤，其特征在于：所述定向肽库由线性肽或环状肽组成，所述线性肽是由(Xaa)_n-Zaa-(Xaa)_m所示的氨基酸组成的多肽，所述环状肽是由环-((Xaa)_n-Zaa-(Xaa)_m-R-R′)所示的氨基酸组成的多肽；其中，Xaa代表任何天然或非天然的a-氨基酸，Zaa代表非简并的天然或非天然的a-氨基酸，R-R′是环状肽的连接处，n和m代表0～10个氨基酸数目。

2.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：采用BOP/HOBt化学反应偶联法合成可溶性的线性肽或可溶性的环状肽或在固定支持相上直接合成线性肽或环状肽，采用Na-FMOC封闭法保护线性肽或环状肽的氨基酸，环状肽在R-R′处连接成环，在环状肽库的简并位置，加入等量的不同种的已用Na-FMOC封闭的氨基酸于反应体系中。

3.根据权利要求2所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述固定支持相为纤维素膜。

4.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述线性肽或环状肽的肽段长度为5～25个氨基酸。

5.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：目标蛋白的体外表达纯化的步骤为：用昆虫细胞表达GST-目标融合蛋白，昆虫细胞用裂解液裂解，所述裂解液包括20mM Tris pH8.0，150mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟化物PMSF，0.15U/mL抑肽酶，20mM亮肽酶素，1mM二巯基苏糖醇DTT和1%乙基苯基聚乙二醇，随后用谷胱甘肽亲和柱纯化目标蛋白。

6.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽库与目标蛋白的反应体系为：将纯化的目标蛋白加入300μL含有1mg线性肽或环状肽混合物的溶液中，所需各种因子的浓度为100mM ATP，包含约6×10⁵cpm的[γ-^32P]ATP，1mM DTT，10mM MgCl₂和50mM pH7.0的Tris，室温孵育10min。

7.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽库的肽段洗脱分离的步骤是：肽段混合物以pH5.5-6.0的高盐溶液上金属离子柱，然后柱子用pH6.0的低盐溶液洗去非磷酸化肽段的非特异结合以及多余的盐离子，最后，以pH8.0的洗脱溶液洗脱结合的磷酸化肽段。

8.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述定向肽库的肽段线性化是由溴化氢打断肽键或由蛋白酶切割。

9.根据权利要求1所述的利用定向肽库检测蛋白质与其他分子相互作用的方法，其特征在于：所述线性化肽段的鉴定采用Edman降解法或质谱法自动化测序。