[发明专利]甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记，同时还涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法，还涉及一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定中的应用。

背景技术

粮食安全是我国国民经济的基础和人民生活的重要保障，种子是粮食生产的最核心要素。我国消费的植物油60%以上依靠进口，自给率不足40%；国产植物油约60%的原料来自于油菜籽。杂交种的选育和推广促进了我国油菜品种产量的大幅度提高，品种更新换代速度加快。开发鉴别品种和鉴定杂种纯度的技术体系用于种子质量管理非常必要和紧迫。

现有的油菜品种鉴定和杂种纯度检测方法主要包括传统的形态学方法和分子检测方法。形态学方法依据的是油菜全生育期的表型性状如叶型、叶色、株高、株型、生长势、花期、产量性状、品质性状等，目标性状有限、且易受外界环境影响（刘华等，1997）。另外，形态学鉴定方法需要田间种植、并在油菜全生育期多次进行观察，非常费时费力。分子检测方法是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础、在分子水平检测生物间的差异。分子检测方法能对各个发育时期的个体、各个组织甚至细胞做检测，标记数量多、不受环境影响。

自1980年第一个分子标记技术—RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性，）产生以来，已经出现的分子标记技术有几十种，它们的原理为DNA分子杂交、DNA分子扩增，以及DNA分子杂交结合分子扩增。每一种分子标记技术在检测的基因序列、多态性水平、位点的特异性、重复性、技术要求以及检测成本等方面各有差异和优缺点。我国自2003年启动甘蓝型油菜品种DNA指纹检测以来，相继经历了AFL P（Amplified Fragment Length Polymophism，扩增片段长度多态性）、SSR（Simple Seque nce Repeats，简单重复序列）和ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats，简单重复间隔序列）三种标记技术，其中SSR标记技术由于重复性好而得到重视。尽管如此，SSR标记技术检测油菜品种DNA指纹存在两大不足：（1）年份、品种、不同操作者所得数据不能整合；（2）分子扩增的品种DNA指纹需要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行检测，操作程序复杂、花费时间长、对操作者技术水平要求高。

SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，序列特征性扩增区域），是1993年Paran(Sartorato et al.,2000)提出的分子标记，基本原理是将特异扩增产物进行回收测序，根据测序结果重新设计特异引物，对基因组DNA进行特异PCR扩增（赵军胜等，2012）。SCAR技术只扩增特定DNA区域，结果仅仅是标记‘有’或‘无’，判别容易，可用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，操作简单，不需要DNA测序仪等精密仪器。SCAR技术可以克服SSR技术的缺点，但是开发SCAR标记的前提是已知差异扩增片段及其序列，由于特异扩增产物回收测序成本高，因而SCAR标记的数量受到限制，规模化开发SCAR标记的报道尚无。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记，该标记具有可用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测、操作简单，扩增结果为“有”或“无”、判别容易、便于统计等优点，适用对象广泛。

本发明的目的之二在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记的制备方法。该方法利用了白菜和甘蓝、以及甘蓝型油菜的基因组序列信息，具有覆盖油菜全基因组、数量多、成本低等优点，另外利用在任何油菜品种均能有扩增产物的标记作为阳性对照，保证了SCAR分子标记结果正确。

本发明的目的之三在于提供了一种甘蓝型油菜全基因组SCAR分子标记在甘蓝型油菜品种鉴定和杂种种子纯度检测中的用途，具有操作程序简单、周期短等技术优势，不同年份、不同品种、不同操作者所得数据均能整合，因而，可以构建历年和当前油菜品种的DNA指纹数据库，并利用指纹库信息进行杂种种子纯度检测。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过序列查询、比对和引物设计，筛选到分布甘蓝型油菜全基因组的SCAR标记110个；得到两个阳性标记PS3+21和RAC1-P3+4以确保检测结果正确；检测2011-2012年国家区域试验冬油菜品种（172份）以验证可用于SCAR分子标记鉴定油菜品种；创建SCAR标记技术体系应用于品种鉴定和杂种纯度检测的方法。