[发明专利]一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制法

权利要求书

1.一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂的制备方法，其特征在于：

先合成一段寡肽序列，按：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第二个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第三个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第四个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去天冬氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第五个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-缬氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去缬氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第六个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的第七个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，最后用按三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：99的混合液40-50毫升从该树脂上切下合成的寡肽片段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，沉淀中乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基；

将上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基取0.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入0.12毫摩尔叔丁氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第一种中间产物L₁；

将上述制备的第一种中间产物L₁溶解在按三氟乙酸与二氯甲烷体积比为95：5的10毫升混合液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第二种中间产物L₂；

将0.12毫摩尔（4-（4-（二甲基氨基）苯基）偶氮）苯甲酸溶于3毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入第二种中间产物L₂0.1毫摩尔，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米及可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第三种中间产物CL₃；

将第三种中间产物CL₃取0.1毫摩尔溶解于按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为5：95的3毫升混合液中，室温搅拌反应二十分钟，经过高效液相色谱分离提纯，收集仅在可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第四种中间产物CL₄；

将第四种中间产物CL₄取0.1毫摩尔溶解于3毫升pH=9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，另取0.12毫摩尔异硫氰酸荧光素异构体I溶解于300微升二甲亚砜中并滴加至第四种中间产物CL₄的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在可见波段442纳米及510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为最终化合物CLY；

其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基，天冬氨酸及谷氨酸的侧链羧基均由4-叔丁酯基保护；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；在每新加入一个氨基酸和切去9-芴甲氧羰基保护基时，都采用凯撒测试（Kaiser Test）试剂检测氨基存在与否：若阳性，显蓝色，即表明已脱除9-芴甲氧羰基保护基；若阴性，显黄色，则表明氨基酸的氨基已发生缩合反应。

2.权利要求1方法制备的对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂，即最终化合物CLY，其特征在于结构为：

，

该最终化合物CLY可以被半胱天冬酶3特异性识别并剪切，剪切后连接物部分断开使得淬灭基团与荧光基团远离，淬灭效果消失，荧光基团发出的荧光可被检测。