[发明专利]乳腺球蛋白mRNA的检测方法及其试剂

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测方法技术领域，具体而言，本发明涉及检测、鉴定和/或定量人循环血中微量乳癌细胞球蛋白mRNA的特异性检测方法。另外，本发明还涉及用于该方法的试剂盒、中间产物以及其应用等。

背景技术

乳腺癌是妇女最常见的致死性癌症之一，手术切除是乳腺癌综合治疗方法中的首选，但乳腺癌切除后的复发率高、转移率高：癌细胞易于从原发灶进入外周血发生肿瘤转移，而肿瘤转移是乳腺癌治疗失败的主要原因。大量实验已经证实循环血中肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTC)检测将有助于乳腺癌早期诊断、复发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。

人乳腺球蛋白(Mammaglobin，MAM)是近年来发现的一种乳腺组织特异性蛋白标志物，在乳腺原发、转移及其外周血癌细胞中特异性表达(Watson et al.，1999，Watson and Fleming，1996，Carter et al.，2002，Zuo et al.，1998)。在国际上利用抗MAM抗体对人乳腺球蛋白的特异性检测已获得专利，如US6566072(Mark A.Watson，Timothy P.Fleming，Washington University，2003)。目前国内也有针对人乳腺球蛋白的特异性检测专利：中国专利(申请)CN03117222.9公开了一种人MAM剪接变异蛋白，利用该蛋白制备单克隆抗体并用于检测MAM；中国专利(申请)CN200510106613.4公开了利用抗体标记的乳胶颗粒来检测MAM的方法及其试剂盒。这些方法都是利用抗体进行MAM检测的，因此检测的准确度对其中的抗体的特异性要求非常高，否则会出现大量假阳性的结果，另外由于抗体试剂本身生产成本高、抗体必须在适宜的条件下保存、运输和使用以防止抗体效价变低，这大大增加了检测成本和检测结果的不确定性。Watson等首先建立用RT-PCR来检测人MAM mRNA的方法(Watson et al.，1999)；中国专利CN200710303872.5建立利用RT-PCR来检测人MAM mRNA表达的方法及其试剂盒。但是，该方法需要利用昂贵的RT-PCR设备，此外完成RT-PCR的过程非常耗时，RT-PCR检测的敏感性和特异性对检测试剂的质量、检测环境纯净度(无DNA交叉污染)依赖很大，否则易出现检测敏感度下降或假阳性结果。这些都是多数基层医院难以克服的。

上世纪90年代初，Tuerk和Gold创立了指数富集式配基系统化筛选(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，简称为SELEX)技术，通过多轮的体外选择和扩增，能够从随机寡核苷酸文库中筛选出特异性适配体(aptamer)，参见(Tuerk and Gold，1990)。目前，人们已经发现了许多分子的特异性适配体，如微生物的适配体、生物大分子(如，血管内皮生长因子，血小板来源的生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-选择素、角化细胞生长因子、γ干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子)的适配体、小分子的适配体，能够特异结合相应微生物、生物大分子、小分子等靶分子，参见CN1490054A、CN1550501A、CN1563401A、CN101148666A、CN101835904A、生物工程学报，20(4)：627-632，等。适配体的优势在于对靶分子的识别具有很高的亲和力，其解离常数甚至可以达到50pmol/L～10nmol/L。另外，由于适配体本身的化学结构是单链核酸，适配体与靶分子的结合可受杂质分子的干扰，尤其是当靶分子和杂质分子都是单链核酸(如，scDNA、mRNA)的情况下，由于核酸链本身存在配对二聚的性质，将增加干扰的情况发生。这些不利因素影响了适配体检测的准确性和精度，使其难以推广进行商业化使用，因此目前基于抗体的ELISA检测或者耗时的PCR检测等仍旧在实践中投入使用。

发明内容

本发明所要解决的第一问题在于克服现有人乳腺球蛋白的特异性检测对环境纯净度要求高、对抗体特异性要求非常高且假阳性率偏高的问题，提供一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法，该方法使用简便、灵敏、特异性强、重复性好、出结果快捷、无需复杂仪器及特别技巧，而且可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测，不会出现适配体与靶分子(MAM mRNA)和其他非特异核酸序列互相干扰的情况。

本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测试剂盒。