[发明专利]对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白技术领域，特别是生物对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法。 

  

背景技术

目前，放射治疗已经成为癌症治疗的最重要手段之一，我国约有70%以上的癌症需用放射治疗，美国统计也有50%以上的癌症需用放射治疗，对于许多癌症病人而言，放射治疗是唯一必须的治疗方法，高剂量辐射可以破坏或消灭癌细胞，但同时也损害正常细胞，导致副作用。同时，因核泄漏或恐怖事件所致人群的急性大剂量辐射暴露往往引起急性辐射综合症，对机体多种器官或组织造成不可逆的损伤，而目前的常规治疗手段仍然仅限于抗生素、输血及补液等对症治疗，一些抗癌药物也被用于此方面的治疗，但副作用巨大。 

辐射防护药品的研究主要集中于生物制剂和化学制剂研发。Lyudmila GB等(Burdelya LG, Krivokrysenko VI, et al. Science, 320(5873): 226-230, 2008; Burdelya LG, Gleiberman AS, et al. Int J Radiat Oncol, 83 (1): 228-234, 2012）曾经用沙门氏菌的鞭毛蛋白经改造后得到TLR-5的激动剂CBLB502蛋白，在辐射损伤保护性研究方面取得较大进展，目前已在美国国防部资助下投入了1.56亿美元开展三期临床实验，在人体试验中证明其良好的辐射防护效果（目前报道最有效的生物类辐射保护剂）。同时，Ex-RAD、AEOL-10150、CLT-008等生物药物也正在加紧研发阶段（Willyard C. nature medicine. 2011, 17(4): 391）。该类药物虽具有良好的辐射防护效果，但均为美国具有自主知识产权的辐射防护药物，基于该类药物良好的军事应用前景及美国国防部资助背景，其使用必然受到美国相关法律法规的保护。国内生物蛋白辐射防护药物的研发较为薄弱，目前报道较多的均为美国研发的CBLB502的克隆复制(王 磊，王治东等，国际药学研究杂志，39(3)：225- 230，2012；王治东，葛常辉等，中华放射医学与防护杂志. 30(2)：169-172,2010；周仕香.苏州大学学位论文，2011)，缺乏自主研发、具有自主知识产权的生物制剂。 

以阿米福斯汀（美国 FDA于1996年批准上市的第1个泛细胞保护剂，目前最有效的辐射保护剂之一）为代表的合成化学试剂在临床应用较广，但其有效剂量接近其耐受剂量(Burdelya LG, Krivokrysenko VI, et al. Science,  2008;320(5873): 226-230)，且具有较大的毒性和副作用，限制了此类药物的推广应用(Weiss JF. Environ Health Perspect. 1997, 105 (Suppl 6) :1473-1478)。 

   

发明内容

本发明旨在解决现有辐射防护生物制剂存在较大的毒性和副作用等诸多技术问题，以提供能有效防护机体大剂量的辐射暴露损伤、具有低毒和低副作用特点的融合蛋白及其制备方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。 

本发明的对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白，其氨基酸序列为N-Flexible peptide-C形式，其中N为嗜肺军团菌鞭毛蛋白N端蛋白成分，Flexible peptide为柔性肽段，C为嗜肺军团菌鞭毛蛋白C端蛋白成分。 

本发明的对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白，其中所述的柔性肽段氨基酸序列为SPGISGGGGGILDSMG。 

本发明的对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白的制备方法，包含如下步骤： 

a)        直接合成氨基酸对应的基因片段；

b)        通过分子重组，将目的基因克隆到相应载体中；

c)        将重组质粒转入宿主细胞诱导表达；

d)        用亲和层析方法纯化目的蛋白，并进行蛋白复性。

首先，查询NCBI嗜肺军团菌鞭毛蛋白氨基酸序列，将N端和C端反转录成DNA序列后，通过密码子优化得到目的基因，在N端和C端之间插入柔性肽片段基因序列，合成基因序列后，连接至pUC57保存备用。目的基因连接至pET30a载体后，转入感受态BL21中，IPTG诱导表达。融合蛋白产物的提纯一般采用亲和层析和分子筛层析，也不排除疏水层析，离子交换层析和HPLC的使用及今后推出的新型层析材料和层析方式的使用。