[发明专利]一种重组大肠杆菌及制备磷脂酶C的方法和大豆毛油脱胶方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和油脂脱胶领域，特别涉及一株重组大肠杆菌制备磷脂酶C的方法及该酶催化大豆毛油脱胶方法。 

背景技术

磷脂酶C（phospholipase C,PLC）可以催化水解磷脂Sn-3位酯键产生甘油二酯(DAG)和磷酸化的头部基团。根据PLC的底物特异性，主要可以将细菌来源的PLC分为2大类：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)和磷脂酰胆碱偏好型磷脂酶C(PC-PLC)。PLC的水解产物三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DAG）在信息传递和细胞代谢中起着重要作用，前者能促使Ca²⁺从钙库中释放出来；DAG能激活蛋白激酶K(PKC)，从而触发一系列细胞内功能，如：细胞增殖，信号空间分布等。PLC在对抗心脑血管疾病，抗血小板聚集和抗肿瘤等方面具有潜在价值。随着PLC研究的深入，其应用范围也在不断拓宽，从医药领域扩展到化工和食品加工等领域，例如：PLC处理神经鞘磷脂生成的神经酰胺被广泛用作化妆品的保湿成分；PLC能够改善冷冻保存的生面团在烤制时产生的表面老化现象、缓和梨皮装表皮；PLC还可以用来做酶法脱胶，进一步提高油脂精炼的效率等。 

产PLC的细菌很多，例如：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)，单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等等。早在上世纪80年代国外就有利用基因工程菌表达PLC的报道：1982年，Vasil等人构建了一株P.aeruginosa PAO2003(pVB81)-CT，该菌株所产PLC的酶活达到442.8U/ml；1997年Cota-Gomez等人构建了E.coli BL21(DE3)pGEM-PLCHR，该菌株所产PLC酶活可达24.1U/mg。国内对PLC研究起步较晚，例如：2003年，王常高等筛选出15株磷脂酶高产菌株；并对其中四株菌进行了分类鉴定；2005年，陈涛等在此基础上，对高产磷脂酶菌株B.cereus ShenZhen754-1进行了紫外线和⁶⁰Co-γ射线诱变处理，获得了3株高产突变株，磷脂酶活性分别达到14.878、16.450、16.400U/ml。2013年，赵金星等成功筛选到一株铜绿假单胞菌，并构建产PLC的重组大肠杆菌，酶活可以 达到722.89U/ml。 

脱胶是大豆油精炼过程中的重要环节，直接关系到精炼油品质的好坏。大豆油中的胶质主要是磷脂，磷脂含量高会影响油的储藏、精炼和加工故需将大豆油的磷含量降低至10ppm以下，才能满足油脂精炼的要求。酶法脱胶反应条件温和，经济环保，而且减小了中性油的损失，PLC脱胶只需少量水分，并可以除去非水化磷脂，能大大减少废水的排放量。孟庆飞等人进行了PLC水解大豆油磷脂的研究，使毛油的精炼率提高了3.08%。Purifine公司已有用于油脂工业脱胶和精炼的PLC产品，大豆毛油中磷脂的质量百分数为1.76%，Purifine PLC能水解其中的70%，生成的DAG80%能留在最终产物中，相当于增加了0.99%的产量。 

PLC在动植物体内表达量十分有限，且提取和分离过程繁琐，成本高。微生物来源，特别是经重组后的基因工程菌来源的PLC具有生产周期短，生产成本低，产量大等优点。但同时也面临一些不可回避的问题，如：产PLC的原始菌株大多是致病菌，应用在食品方面存在安全隐患；相较于传统的酸法脱胶，酶法脱胶仍然面临成本较高的问题，若能实现PLC的有效固定化可以大大降低油脂精炼的成本；另外，普通微生物来源的PLC对酸和热的耐受性均不理想，大大限制了其在食品工业中的应用，故需要筛选或改造出具有更强耐酸和耐热性能的PLC。 

发明内容

鉴于上述和/或现有酶基因工程和酶工程领域中存在的问题，提出了本发明。 

因此，本发明其中一个目的是提供一种重组大肠杆菌。 

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a-Sa-PLC，保藏编号为CCTCC No.M2013300。