[发明专利]大麦原生质体制备及PEG介导转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及原生质体的培养技术，特别涉及一种PEG介导的大麦原生质体高效瞬时转化体系。

背景技术

大麦是禾本科大麦属的一年或越年生草本植物， 具有生育期短、早熟、气候适应性广以及适合轮作等特性， 在世界各地广泛种植， 为全球栽培的第四大和谷类作物。用途广泛，主要用于动物饲料、麦芽制造、食品制造、医药等方面。虽然目前有很多方法进行大麦转基因，但是效率低，并且费时费力，严重影响了对大麦遗传及分子方面的研究。

在过去的数年中，植物原生质体的培养及转化体系有了较大的进步。原生质体转化试验操作简单，省时经济，可应用于基因表达、蛋白定位、蛋白互作、胁迫、激素及代谢通路等的研究。在以大麦为材料的研究中，曾有从悬浮细胞中提取原生质体，但是目前还没有以大麦原生质体为材料进行基因转化的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种大麦原生质体制备及PEG介导转化方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种用于PEG介导转化的大麦原生质体的制备方法，包括以下步骤：

（一）大麦幼苗的培养

大麦种子经自来水中浸泡2 h后，用10％次氯酸钠表面消毒30 min，再用ddH₂O清洗8次；消毒后的种子平铺在湿滤纸上，25℃下萌发；36 h后，种子露白，选取长势良好的种子进行水培法培养：在pH 5.8的0.1mmol·L^-1 CaCl₂培养液中，以8小时光照/16小时黑暗的条件于25℃培养5天后，得到用于原生质体提取试验的大麦幼苗；

（二）原生质体的制备

（1）首先配制酶液10ml和0.3M甘露醇10 ml；

所述酶液的组份为：0.3 M的甘露醇、10 mM的MES、1.5%（wt/vol）的纤维素酶R10、0.75%（wt/vol）的离析酶R10、1mM的CaCl₂、0.1%（wt/vol）的BSA、1 mM的β-巯基乙醇，余量为ddH₂O；

（2）取50棵幼苗的茎段或5-7片叶子于灭菌的滤纸上，用新的刀片将其切成0.5-1 mm的薄片，切好后迅速加到有10 ml  0.3 M甘露醇的100 ml三角瓶中，以锡箔纸包好三角瓶，黑暗中放置10 min；

（3）用移液器弃甘露醇，尽量吸净；加入10 ml酶液，锡箔纸包好三角瓶，放入真空罐中，抽真空条件200 psi以下，平板摇床上30转/分钟培养30 min；从真空罐中取出三角瓶，空气中平板摇床上30转/分钟，培养3.5 h；

（4）加入等体积的W5试剂，平板摇床上40转/分钟，培养10 min；

所述W5试剂的组份为：154 mM 的NaCl、125 mM 的CaCl₂、5 mM 的KCl 、2 mM 的MES ，余量为ddH₂O ；

（5）用W5试剂润湿100目的细胞筛，过滤步骤（4）中的培养产物，滤液用50 ml圆底离心管收集，再用20ml W5试剂冲洗；

（6）500 rcf常温离心3 min后，吸去上清；试管底部为绿色的一层原生质体；

（7）加入2 ml W5试剂，轻柔摇晃离心管，使细胞悬浮；吸取细胞悬浮液至10ml圆底离心管中，锡箔纸包好使离心管避光，原生质体自然沉降30 min后，500 rcf离心3 min；移液器小心移去上清；留在圆底离心管底部的即为大麦原生质体。

本发明还提供了利用所述大麦原生质体的PEG介导转化方法，包括以下步骤： 

（1）在2 ml圆底离心管中加入5 ug的 pUGW11-GFP质粒，ddH₂O定容至10 ul混匀；再加入100 ul所述大麦原生质体，轻轻混匀后，加入110 ul PEG–Ca²⁺试剂，轻轻混匀后，于25 ℃室温、黑暗放置20 min；

以大麦幼苗的茎为材料时，PEG–Ca²⁺试剂的组份为：0.3 M的甘露醇、0.1 M 的CaCl₂ 、40%W/V的PEG 4000，余量为ddH₂O；

以大麦幼苗的叶片为材料时，PEG–Ca²⁺试剂的组份为：0.4 M的甘露醇、0.1 M 的CaCl₂ 、40%W/V的PEG 4000，余量为ddH₂O；