[发明专利]一种针对人Tudor-SN蛋白T73位点的应激磷酸化抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种针对人Tudor-SN蛋白T73位点的应激磷酸化抗体的制备。

背景技术

Tudor-SN（tudor staphylococcal nuclease），又称p100蛋白、SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1），是首次作为EBNA2（Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EB病毒细胞核抗原2）转录调控激活因子被发现的一种多功能蛋白。

人Tudor-SN蛋白由N端4个重复葡萄球菌核酸酶样（Staphylococcal nucleases-like，SN-like）的SN（1~4）结构域及C端的SN5a-Tudor-SN5b（TSN）结构域组成（图1）。SN（葡萄球菌核酸酶），又称为耐热核酸酶，是一种Ca²⁺依赖酶，可水解单/双链DNA和RNA的5’-磷酸二酯键，生成3’-单核苷酸和多核苷酸。SN结构中含有可识别多种核苷酸的保守OB折叠结构（寡聚核苷/寡聚糖结合折叠），这是Tudor-SN与多种核酸物质结合的机制之一。

H₂O₂氧化应激状态下的大鼠血管平滑肌细胞Tudor-SN基因表达上调；Tudor-SN蛋白可与含IU碱基对的I-dsRNA同时定位于细胞应激颗粒中。恶性疟原虫Tudor-SN蛋白的SN结构域可与冷休克DNA结合蛋白（cold-shock DNA binding protein）相互作用，提示Tudor-SN蛋白可能参与细胞冷休克应激。Micrarchus nov. sp. 2昆种Tudor-SN mRNA在给予0℃冷休克刺激1h后会发生表达上调，提示Tudor-SN可能是一种应激冷响应基因。Tudor-SN蛋白有助于提高植物应激耐受力（stress tolerance）并可稳定对应激敏感的mRNA水平，对于植物在高盐、高渗环境的生长和生存至关重要。Tudor-SN蛋白可与ADAR（Adenosine deaminases acting on RNA）蛋白直接结合参与应激颗粒构。Tudor-SN蛋白还可通过SN结构域与G3BP蛋白直接结合；给予细胞45℃热休克或亚砷酸盐应激处理后，Tudor-SN可在胞浆中形成应激颗粒；当下调内源性Tudor-SN蛋白表达水平时胞内应激颗粒的初始形成并未受到抑制，但从小到大的颗粒聚集过程受到影响，提示Tudor-SN蛋白可能并非应激颗粒形成的启动因子，但会影响颗粒聚集效率。

Tudor-SN蛋白可与马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）的非结构蛋白（Non-structural protein 1，nsp1）结合参与调节病毒亚基因组mRNA的合成。Tudor-SN蛋白与传染性胃肠炎冠状病毒（transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV）基因组的3’端结合而影响病毒的复制过程。Tudor-SN蛋白可与革登热病毒（Dengue virus，DENV）基因的3’UTR结合，且对该病毒的复制过程至关重要。此外，Tudor-SN蛋白还可参与基因转录、剪接体加工、细胞增殖、RNA干扰、病毒感染等多种细胞生物学事件。多功能Tudor-SN蛋白具有较为广泛且重要的生物学作用，其中任一环节出现异常，都有可能引起一定的临床疾病。Tudor-SN蛋白与哮喘、过敏、结肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌等多种人类疾病相关。

发明内容

本发明目的是解决有效研究人Tudor-SN蛋白的表观遗传修饰问题，提供一种针对人Tudor-SN蛋白T73位点的应激磷酸化抗体制备方法。

本发明制备的应激磷酸化抗体有助于探讨Tudor-SN蛋白的表观遗传修饰在肿瘤增殖、迁移等过程中的作用机制，为临床肿瘤疾病的诊疗提供潜在的作用靶点。Tudor-SN蛋白功能的多样性有赖于自身蛋白的翻译后修饰作用，比如磷酸化修饰。

本发明提供的针对人Tudor-SN蛋白T73位点的应激磷酸化抗体的制备方法，包括以下步骤：

第1步、首先确定Tudor-SN蛋白应激磷酸化位点

首先通过近红外双色激光成像发现受到外界环境氧化应激时人Tudor-SN蛋白（NP_055205.2）会发生磷酸化，然后通过质谱分析确定是在Tudor-SN蛋白73位点苏氨酸Thr发生转录后磷酸化修饰；

第2步、合成包括T73磷酸化位点的半抗原多肽