[发明专利]一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及草鱼（Ctenopharyngodon idella）肿瘤坏死因子α（ΤΝF-α)基因的克隆、重组表达、表达产物的分离纯化与活性鉴定等技术。

背景技术

肿瘤坏死因子alpha（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）是一种重要的细胞因子。早在30多年前，Carswell等人发现了一种存在于血清中，能抑制和杀伤某些肿瘤细胞，并使体内肿瘤发生出血坏死的蛋白物质，被命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)。Shalaby等人把由活化的单核细胞、巨噬细胞和T细胞分泌的肿瘤坏死因子，命名为TNF-α；而把由活化的T淋巴细胞和NK细胞分泌的淋巴毒素，命名为TNF-β。TNF-α前体是Ⅱ型跨膜蛋白，经TNF-α转换酶(TNF-αconverting enzyme,TACE)裂解后，形成释放到胞外的可溶性成熟分子。在生理条件下，TNF-α以非共价三聚体结构与细胞表面的两种特异性跨膜受体TNFR1和TNFR2结合，启动下游的信号转导通路，从而参与和调控机体的免疫功能和炎症反应，发挥促进细胞生长、分化、凋亡等重要作用。自从牙鲆中克隆出第一个TNF-α基因的全长cDNA序列开始,肿瘤坏死因子α在鱼类中的研究开始受到重视。目前在多种鱼中已有肿瘤坏死因子α基因克隆，其中包括：河豚（Savan2005）、虹鳟（Laing2001）、金头鲷（Garcia-Castillo2002）、鳜鱼（Xiao2007）、斑马鱼（Savan）、鲤鱼（Saeij2003）、金鱼（Grayfer2008）等。重组金鱼肿瘤坏死因子能诱导巨噬细胞的趋化反应、吞噬作用、呼吸爆发反应（Grayfer2008）。重组虹鳟肿瘤坏死因子α能增强白细胞的迁移和吞噬作用，并能上调IL-1β、IL-8、TNF-αCOX-2等基因的表达（Zou2003）。但是，重组乌颊鱼TNF-α和大菱鲆TNF-α不能激活吞噬细胞的呼吸爆发（Roca2008，Orda′s2007），而且重组乌颊鱼TNF-α只能轻微上调IL-1β和TNF-α的表达（Roca2008）。这些鱼类TNF-α表现出的功能差异说明其功能具有种属特异性，因此有必要获得重组草鱼TNF-α用于其在草鱼中的功能检测和应用。

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，俗称有：鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草鱼、草根（东北）、混子、黑青鱼等。英文名：Grass carp。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等。加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其调节机制十分重要。由于肿瘤坏死因子α在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，因此检测肿瘤坏死因子α在草鱼中的功能对草鱼免疫系统的研究以及鱼类疾病的治疗密切相关。同时，由于鱼类肿瘤坏死因子α与哺乳动物和两栖动物的肿瘤坏死因子α分子在结构和功能方面存在较大差距，不能用其他种族的肿瘤坏死因子α蛋白蛋白和抗体代替鱼类肿瘤坏死因子α进行研究，加之鱼类肿瘤坏死因子α抗体的缺乏使对肿瘤坏死因子α功能地位的研究陷入瓶颈。

本发明的有益效果：通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白。重组草鱼肿瘤坏死因子α不仅可用于制备相应鱼类肿瘤坏死因子α抗体和其它鱼类免疫机制的理论研究，也可用于制作饲料添加剂、疫苗免疫增强剂以及病害防治药物以及其它医药产品等应用研究；同时，草鱼肿瘤坏死因子α能诱导草鱼其它细胞因子的表达，如白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α自身，从而增强草鱼趋化能力，提高草鱼免疫保护能力。

发明内容

肿瘤坏死因子α在机体免疫调节等方面起着非常重要的作用，但是由于机体自身分泌肿瘤坏死因子α存在产量低、半衰期短等不足，本发明针对这些问题根据草鱼肿瘤坏死因子α基因，采用克隆重组技术，构建草鱼肿瘤坏死因子α体外重组质粒，通过大肠杆菌表达载体，经诱导在体外大量表达重组草鱼肿瘤坏死因子α蛋白，并对其进行分离纯化和鉴定，提供草鱼肿瘤坏死因子α蛋白的重组表达方法，为草鱼肿瘤坏死因子α蛋白的产业化应用提供可能性。同时，本发明也为制备相应鱼类肿瘤坏死因子α抗体和相关鱼类免疫机制的理论研究奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：