[发明专利]一种重组大肠杆菌及制备磷脂酶C的方法和应用

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-L.m-PLC，保藏编号为CCTCC No.M2013301。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-L.m-PLC，CCTCC No.M2013301，其特征在于：由下述方法制得：

（1）以保藏编号为CICC No.21540的单核细胞增多性李斯特菌（L.monocytogenes）的基因组为模板，克隆得到磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）将步骤（1）所得磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a（+）上，得到重组载体；

（3）将步骤（2）所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。

3.用权利要求1或2所述重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET-lm-plc，CCTCC No.M2013301制备磷脂酶C的方法，其特征在于：以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备磷脂酶C。

4.根据权利要求3所述制备磷脂酶C的方法，其特征在于：包括，

（1）种子培养：将所述重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-L.m-PLC，CCTCC No.M2013301接种于种子培养基中，于28℃～37℃振荡培养6h～14h，摇床转速150～220r/min；

（2）液体发酵培养：将经过步骤（1）培养所得活化种子液按体积百分比1～10％的接种量接种至发酵培养基，于28～37℃振荡培养4h～6h小时，摇床转速150～220r/min；再添加乳糖，于18℃～32℃振荡诱导培养10～25h，摇床转速150～220r/min；最后添加甘氨酸，于相同条件下继续振荡诱导培养20～40h，发酵完毕，得到发酵液；

（3）粗酶液的提取：将步骤（2）所得发酵液离心；收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀用Tris-HCl重悬后超声破碎，将所得超声破碎液离心，收集上清，即为胞内粗酶液。

5.根据权利要求4所述制备磷脂酶C的方法，其特征在于：步骤（1）所述种子培养基成分按克/升计为：蛋白胨8～12g，酵母粉3～10g，NaCl8～12g，其余成分为水，pH7.2～7.6。

6.根据权利要求4所述制备磷脂酶C的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵培养基成分按克/升计为：蛋白胨8～12g，酵母粉5～25g，甘油0～6g，其余成分为0.25mol/L Tris-HCl（pH7.2）。

7.根据权利要求4所述制备磷脂酶C的方法，其特征在于：步骤（2）所述乳糖的添加量为每升所述发酵培养基1～10g。

8.根据权利要求4所述制备磷脂酶C的方法，其特征在于：步骤（2）所述甘氨酸的添加量为每升所述发酵培养基0～5g。

9.一种植物毛油脱胶的方法，其特征在于：包括，

植物毛油的预热和酸预处理；

加入如权利要求3所述的磷脂酶C进行反应；

灭酶，离心分离完成脱胶。

10.根据权利要求9所述植物毛油脱胶的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将植物毛油于具塞三角烧瓶中水浴加热到60～80℃，加入质量为总毛油质量0.5%的质量浓度为25%～50%柠檬酸溶液，在300～500r/min搅拌条件下进行15～25min的酸预处理。

（2）将经过酸预处理的油样冷却到40～60℃，加入一定量的4%NaOH溶液混合均匀来调节pH至4～7。

（3）再加入油重1%～3%的蒸馏水，和400～2000U/Kg的所述磷脂酶C，均匀混合，在40℃～75℃下300r/min～500r/min搅拌1～2h，进行酶反应。

（4）将反应体系升温至90℃以上进行灭酶10min，在8000～10000r/min进行10min离心分离，即完成所述磷脂酶C对植物毛油的催化脱胶。