[发明专利]一种用于NO检测的大Stokes位移荧光探针及其合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于NO检测的大Stokes位移荧光探针及其制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

NO作为活性氧自由基和活性氮自由基的核心和本源，广泛参与动植物的生理和病理过程。NO作为血管舒张因子，促进血管舒张和降低血压；作为信使分子，涉及神经信号的传递，具有加强记忆和增强学习能力。同时NO还参与免疫防护、调节炎症和抑制肿瘤细胞扩散等。对植物而言，NO打破种子的休眠、促进根部的发育、诱导叶的生长、延缓果实的成熟等，同时还参与干旱、机械损伤、抗病虫害等生物或非生物胁迫反应。因此，NO的检测在生物、医学等领域具有重要意义。

荧光探针在分析检测上具有专一性好、选择性高和识别响应快的特点；荧光探针在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测对象的需要；同时，荧光探针可与荧光光度计、高效液相色谱、毛细管电泳和高分辨显微镜结合，不仅提高分析检测的灵敏度和选择性，还能提供荧光成像和三维时空分布，极大拓宽了荧光探针的应用范围，非常适合NO的生物医学分析。

二氟化硼二吡咯甲烷（Boron dipyrromethene，简称BODIPY）作为有机小分子荧光探针的一员，不但秉承了有机小分子的较低生物毒性和良好的细胞膜透过性，而且还具有荧光量子产率高、光稳定性好、摩尔吸光系数大、不易受溶剂和pH值的影响等优点，在荧光标记和生物成像领域有着广阔的应用前景。然而，现有的BODIPY类荧光探针激发和发射大多处于可见光光谱区域（500-550nm），而且探针的Stokes位移一般只有10nm左右。在可见光谱区域，生物样品有较强的背景荧光和自吸收，会给检测与成像带来干扰，影响测量的准确性。同时，可见光的波长较短，在荧光成像中的辐射能量较大，易造成细胞和生物组织的光损伤。另外，探针的Stokes位移太小，会导致其吸收光谱和发射光谱的较大重叠，从而产生自吸收和散射光干扰。因此，发展激发和发射波长在长波长区域（600-900nm）、且Stokes位移较大的BODIPY荧光探针，在保持BODIPY固有优势的基础上，可克服以上不足，在NO的定量分析与荧光成像领域具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种红色荧光和大Stokes位移的BODIPY类NO荧光探针。

一种大Stokes位移NO荧光探针，其结构如下所示：

上述结构中，3,4-二氨基苯基可与NO发生反应，生成三氮唑类衍生产物。

本发明还提供上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）3,4-二硝基苯甲酰氯溶于1,2-二氯乙烷，在氮气保护下缓慢滴加2-(4-甲氧基苯基)-1氢-吡咯的1,2-二氯乙烷溶液，混合溶液加热回流；冷却至室温后，加入三乙胺，室温搅拌，接着加入三氟化硼乙醚，在氮气保护下加热回流；旋转蒸发除去有机溶剂，将得到的固体经硅胶柱层析纯化，得到蓝色固体4,4-二氟-8-(3’,4’-二硝基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷，其结构如下：

（2）在氮气保护下，4,4-二氟-8-(3’,4’-二硝基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷溶于乙醇，加入钯碳催化剂和水合肼，加热回流，冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化，得到蓝色固体4,4-二氟-8-(3’,4’-二氨基苯基)-3,5-二(4-甲氧基苯基)-二吡咯甲烷p-MOPB。

本发明提供的探针基于BODIPY结构，其荧光性质具有BODIPY的特性，即光稳定性好、对pH和溶剂等均不敏感，同时探针与NO的衍生速度快，条件温和，非常适合液相色谱、毛细管电泳和荧光显微镜分析检测生物样品中NO的定量分析与荧光成像。

本发明提供的荧光探针可以用于化学样品、生物样品或医学样品中NO的定量分析与荧光成像。

本发明提供的探针，突出优点是：

1.BODIPY类荧光探针的荧光发射波长大多位于500nm附近，但基于BODIPY的本探针与NO衍生产物的荧光波长长，达到620nm，有利于避免生物样品背景荧光的干扰。

2.BODIPY类荧光探针的Stokes位移仅有10nm，但基于BODIPY的本探针与NO衍生产物Stokes的位移达到38nm，有利于避免分析检测中的散射光干扰。

3.合成简单，便于推广应用。

附图说明

图1.p-MOPB的合成路线。