[发明专利]单珠光子晶体微球液相芯片化学发光法高灵敏度检测黄曲霉毒素B1的方法

说明书

技术领域

本发明设计农产品、饲料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本检测技术方法。具体通过谷物中典型的黄曲霉毒素B1为检测对象，利用三维光子晶体为载体，通过竞争免疫方法在单珠光子晶体微球表面构建液相芯片检测新技术。

背景技术

黄曲霉毒素是20世纪60年代，人们对英国的约10万只火鸡突然死亡事件的分析后发现的一种毒素。黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉所产生的一类具有强致癌性的次级代谢产物。黄曲霉毒素广泛分布于自然界中，在大米、小麦、玉米等粮食作物及牛奶、调味品、食用油等中均有发现。目前已知的黄曲霉毒素有20多种，其中以黄曲霉毒素B1毒性最强。黄曲霉毒素主要影响人类的肝脏，不同浓度及摄入方式会产生如肝硬化、肝细胞坏死等不良影响，严重的可诱发肝癌，危及生命。黄曲霉毒素不仅毒性猛烈，而且对食品及农产品的品质也会产生较大的影响，往往会使产品组分发生变化，改变产品的颜色、味道等，降低营养价值。鉴于此，世界大多数国家、地区及相关组织机构对食品中黄曲霉毒素的含量有着严格的规定，并且积极研究相关检测方法。目前常用的检测方法有色谱法、免疫分析法等。色谱法主要包括薄层色谱法、气相色谱法及液相色谱法。免疫分析法包括免疫亲和柱层析法、酶联免疫吸附法等。这些常用的检测方法长期以来对黄曲霉毒素的检测起着非常重要的作用。但是随着经济的发展和经济交流的日益增强，人们生活水平的提高，食品安全意识的不断增强以及新型的有害物质的出现；同时许多国家为了保护本国国民健康或者制造技术性贸易壁垒，都规定了农产品、食品和饲料中黄曲霉毒素的含量标准。传统的检测方法已经逐渐显现出不足，如检测成本高，试剂用量大，检测仪器昂贵，检测时间长等缺点。基于此，研究和开发一种新型的高灵敏度、高通量、低成本、检测时间快、特异性好的检测技术和方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明目的在于开发一种高灵敏度、高通量、低成本、检测时间快、特异性好的检测食品中黄曲霉毒素B1新技术，以替代传统色谱技术或酶联免疫法（ELISA）黄曲霉毒素B1检测的方法。

本发明的原理如图1所示，在光子晶体微球用双氧水：浓硫酸（3：7）溶液进行羟基化修饰，用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）环氧基修饰，固定黄曲霉毒素B1包被抗原，牛血清蛋白（BSA）封闭。包被的抗原与黄曲霉毒素B1标准品或试样中黄曲霉毒素B1竞争结合黄曲霉毒素B1抗体，用标记有辣根过氧化物酶的二抗与黄曲霉毒素B1抗体特异性结合，添加化学发光底物后，用多功能酶标仪检测化学发光信号值强弱。建立标准曲线和检测食品中的黄曲霉毒素B1。

本发明所述用单珠光子晶体微球流式芯片检测黄曲霉毒素B1的方法，是采用光子晶体微球为黄曲霉毒素B1探针载体，在微球表面进行直接竞争免疫检测黄曲霉毒素B1，通过黄曲霉毒素B1与微球表面固定抗原竞争结合该毒素单克隆抗体，利用标记有辣根过氧化物酶的二抗与抗体特异性结合后加入化学发光底物，利用多功能酶标仪检测化学发光信号强度。

上述方法包括以下步骤：

（1）光子晶体微球的制备

（2）光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面进行环氧基修饰；

（3）抗原的固定：通过化学键合的方法将黄曲霉毒素B1人工抗原（AFB1-BSA）固定于经步骤（2）表面修饰的微球表面。

（4）用光子晶体微球流式芯片对待测样品进行竞争免疫检测，利用标记有辣根过氧化物酶的二抗与黄曲霉毒素B1抗体进行特异性反应，加入化学发光底物后，用酶标仪对发光信号强度进行检测。

光子晶体微球的制备：将装有单分散纳米二氧化硅乳液的1号注射器及装有甲基硅油的2号注射器连接到三通管上，利用微流注射泵将甲基硅油和单分散纳米二氧化硅乳液通过三通管混合包裹，并通过玻璃管流入疏水性的收集器皿中，在界面力的作用下单分散纳米二氧化硅乳液形成球状结构。

将制备好的液态微球置于60℃烘箱内，加热9小时，使液态微球中的水分逐渐蒸发并使单分散纳米二氧化硅微球进一步自组装。微球成型后，用正己烷浸泡微球，每次10min，直至将甲基硅油洗净，后用无水乙醇清洗微球4次，将正己烷完全洗净。将清洗好的微球至于管式炉中煅烧，升温速度为2℃/min，升至700℃，保温3小时，后自然降至室温。

光子晶体微球表面化学修饰