[发明专利]一种基于桥式PCR检测DNA羟甲基化的方法

说明书

技术领域

本发明属于利用芯片进行DNA羟甲基化检测的高通量高灵敏检测技术。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是新发现的一种的修饰碱基(KriaucionisandHeintz,2009;Tahilianietal.,2009),以低水平存在于哺乳动物的多种细胞类型中。5hmC是10-11易位(TET)家族的酶通过氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(MBD)与甲基化DNA的亲和性,具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能,而且参与了DNA去甲基化过程，5hmC可能成为某些疾病诊断的新的分子标志物。因此关于5hmC的研究日益受到学者们的青睐。而5hmC检测方法的研究则是进行5hmC功能分析的前提与重要保证。目前主要有如下检测方法：一种是基于5hmC敏感酶切方法，另一种是基于抗体识别5hmC的免疫共沉淀法。前一种方法，已有商品化试剂盒。其基本原理是，首先用β-葡萄糖基化酶处理5hmC,将其特异性地转变成β-葡萄糖基-5羟甲基胞嘧啶(5ghmC)，然后再基于甲基化敏感限制性内切酶MspI识别并切割未修饰胞嘧啶或5mC，5ghmC则不受影响。然后用定量或半定量PCR放大酶切后的基因片段，发生5hmC可以被扩增，未发生5hmC则不可以被扩增。该方法具有较低的成本，但检测通量有限。后一种方法主要包括5hmC免疫沉淀(5hmCimmunoprecipitation,5hmC-IP)[LiW,LiuM.Distributionof5-hydroxymethylcytosineindifferenthuman tissues.JNucleicAcids,2011,2011:870726]、抗5-亚甲基磺酸胞嘧啶(antiserumto cytosine5-methylenesulphonate,anti-CMS)[PastorWA,PapeUJ,HuangY,etal.Genome-widemappingof5-hydroxymethylcytosineinembryonicstem cells.Nature,2011,473(7347):394-7]、结合蛋白J(J-bindingprotein,JBP)沉淀[Song CX,SzulwachKE,FuY,etal.Selectivechemicallabelingrevealsthegenome-wide distributionof5-hydroxymethylcytosine.NatBiotechnol,2011,29(1):68-72]、糖基化、高碘酸氧化和生物素化(glucosylation,periodateoxidation,biotinylation,GLIB)处理等[antiserumtocytosine5-methylenesulphonate,anti-CMS)[PastorWA,PapeUJ,HuangY,etal.Genome-widemappingof5-hydroxymethylcytosineinembryonicstemcells.Nature,2011,473(7347):394-7]。这些方法的基本原理是基于抗体能够识别5hmC位点，通过抗体对5hmC的免疫共沉淀，再将沉淀的5hmC片段进行克隆后sanger测序或高通量测序。这些检测方法虽能实现全基因组的5hmC位点所在片段序列及5hmC分布特征的检测，但因抗体免疫易出现非特异结合造成假阳性结果，难以精确分析特定碱基5hmC的情况以及检测成本高的缺点。基于以上分析，有必要发展一种检测5hmC的高通量、低成本及高特异的方法。

发明内容

发明目的：基于以上原因，本发明拟提供一种高通量、高特异性、高灵敏度、低成本、操作简便易行的5hmC位点检测的有效方法。

本发明是以如下技术解决方案实现的：

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种基于桥式PCR检测DNA羟甲基化的方法，首先将不同扩增DNA羟甲基化位点的正反向引物固定到芯片或微球；其次，用β-葡萄糖基转移酶将DNA上所有5hmC进行糖基化，再用MspI酶进行酶切，发生羟甲基化的CCGG不能够被切开，未发生羟甲基化的CCGG能够被切开；然后，再以酶切后基因组DNA为模板与芯片进行杂交，并进行在片桥式PCR:CCGG位点发生羟甲基化的因不能被酶切，而能够进行扩增；反之，CCGG位点未发生羟甲基化的因能被酶切，而不能进行扩增；最后，根据芯片不同矩阵点荧光的有无，判断出基因组DNA不同位置的CCGG是否发生了羟甲基化；