[发明专利]一株铵根离子耐受型产丁二酸大肠杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株铵根离子耐受型产丁二酸大肠杆菌的筛选及应用，属于工业微生物育种及其发酵技术领域。 

背景技术

丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一。 

相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为酸成为近年来研究的热点。 

发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一,多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸,丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前,丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产丁二酸放线杆菌(Actinobacillu ssuccinogenes)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)等。其中Escherichia coli由于遗传背景清楚，基因操作简单，生长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。 

发酵法生产丁二酸的过程中需要加碱调节pH来维持菌体的最适生长产酸。目前能实现的工艺要求的pH调节剂主要有钠盐、钙盐、镁盐以及浓氨水，前三者有试剂消耗量大、价格昂贵、下游提取工艺复杂等缺点，而采用氨水调节pH发酵生产丁二酸工艺中，不需要消耗大量的试剂，生产的副产物少，结晶的丁二酸是唯一产物，该工艺具有闭合、清洁、廉价和高效等优点。 

本申请人的在先专利中国专利申请菌株BER108（中国专利公开号102643770A，保藏编号CCTCC NO：2012068），由于铵离子对该菌株的生长和产酸都有抑制作用，用氨水调pH发酵效果不理想。为了实现氨水调节pH的廉洁工艺，选育可以耐受高浓度铵离子产丁二酸的菌株的工作显得尤为必要。通过改良菌株，使其可以在厌氧条件下耐受高浓度铵根离子并大量积累产酸，在今后的丁二酸生长工业中具有举足轻重的作用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一株高浓度铵根离子耐受型的大肠杆菌，使其可以积累丁二酸。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 

一株铵根离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308，其保藏编号为：CCTCC NO：M2013157。 

以氨水为pH调节剂进行丁二酸生产，当目标丁二酸产量为30g/L时，即丁二酸铵盐浓度为0.25mol/L，计算得NH₄⁺浓度为0.5mol/L。故菌株至少需耐受0.5mol/L铵根离子浓度。以(NH₄)₂HPO₄提供铵根离子，考察了添加不同浓度铵根离子对BER108生长性能和产酸的影响。由图1可知，当铵根离子浓度为0.125mol/L和0.25mol/L时，菌体生长和产酸性能相差不大。然而，当培养基中铵根离子浓度达到0.5mol/L时，菌体的生长和产酸明显受到影响，菌体OD₆₀₀仅为0.45，丁二酸产量仅为3.96g/L。该结果说明在高浓度铵根离子浓度下菌体生长以及产酸都受到严重的抑制。因此，选育一株厌氧条件下耐受高浓度铵根离子（0.5mol/L）并大量积累产酸的菌株是很有必要的。 

本发明所述的耐受高浓度铵根离子，纯厌氧发酵产丁二酸的大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308的筛选方法，将大肠杆菌的出发菌株BER108经等离体诱变后，利用高浓度铵根离子合成培养基平板筛选得到能够在厌氧条件下生长的菌株，在经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产产丁二酸的菌株为目标菌株。 

其具体步骤如下：