[发明专利]磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒

权利要求书

1.一种磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于包括以下步骤：

<1>处理待测样品；

<2>将半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清蛋白的偶联物作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，分别加入系列标准样品或经前处理的待测样品，再加入磺胺二甲嘧啶单克隆抗体进行反应；

<3>经步骤<1>后，加入酶标二抗进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品和待测样品的发光值；

<4>以步骤<3>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中磺胺二甲嘧啶的含量。

2.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于：

步骤<1>参照农业部1025号公告－24-2008标准进行；

步骤<2>按以下操作进行：用包被液按1:100000稀释包被抗原，每孔加入100μL，4℃孵育10h后，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入350μL封闭液，37℃孵育1h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37℃烘干后，用锡箔纸真空密封，4℃保存；将化学发光板从4℃中取出，平衡至室温，按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后每孔加入50μL磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，混匀，37℃孵育30min；倾去液体，用洗板机洗涤3次，拍干；

步骤<3>按以下操作进行：每孔加入50μL1:2500稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min；倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入100μL化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值。

3.根据权利要求2所述的磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于：所述封闭液是5%的脱脂奶粉；所述磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的稀释倍数为1:1500；所述系列标准样品溶液的浓度为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；所述包被液是pH9.6的碳酸盐缓冲液。

4.一种磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测试剂盒，其特征在于包括包被有包被抗原的化学发光板、磺胺二甲嘧啶系列标准样品溶液、磺胺二甲嘧啶单克隆抗体工作液、浓缩洗涤液、HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化学发光液；所述包被抗原为磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清蛋白的偶联物；所述磺胺二甲嘧啶系列标准样品溶液为6个浓度梯度，分别是0μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；所述浓缩洗涤液由NaCl8.00g、KH₂PO₄0.20g、Na₂HPO₄·12H₂O2.90g、KCl0.20g、吐温-200.50mL，加水定容至100mL制成；所述化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018--BeyoECL Plus。

5.根据权利要求4所述试剂盒在动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测中的应用。

6.一种磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，其特征在于按以下操作制备：以半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选，对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次，经过鉴定、冻存和建株后，进行腹水的制备，然后通过纯化腹水，获得能特异性识别磺胺二甲嘧啶的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，其特征在于按以下操作制备：

<1>动物免疫

将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；

<2>细胞融合和克隆筛选

冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，利用细胞融合技术将小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞进行融合，融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；

待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100μL上清，加至已包被抗原的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；

<3>细胞冻存与复苏

用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中培养；

<4>腹水的制备与纯化

采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水经饱和硫酸铵初纯和亲和层析后，即得磺胺二甲嘧啶单克隆抗体。