[发明专利]抗泥鳅病原霍乱弧菌的卵黄抗体灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，特别涉及一种抗泥鳅病原霍乱弧菌的卵黄抗体灭活疫苗的制备方法。 

背景技术

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus L）是我国主要淡水经济鱼类之一，其肉质鲜嫩，营养丰富，具有食用、药用双重价值，深受消费者的青睐。近年来，由于韩国、日本等周边市场对我国泥鳅的大量需求，泥鳅人工集约化养殖迅速发展，尤其是在苏北地区已形成了大规模养殖，但随之而来的病害问题已严重制约了泥鳅养殖业的发展。近年来我们在对泥鳅细菌性疾病调研中，发现霍乱弧菌为泥鳅细菌性疾病的主要流行病原菌之一，严重危害泥鳅养殖生产。该菌广泛分布于水环境，已知有不少血清型株能引起水产动物感染发病，该菌还可引起人散发胃肠炎，在特殊条件下也可引起败血症、脑膜炎、伤口感染等肠道外感染，是人和水产养殖动物共染的病原菌。因此，对泥鳅病原霍乱弧菌的高效预防，以最大限度地降低其危害程度，将能显著地提高泥鳅养殖生产的经济效益。 

在泥鳅细菌性疾病防控方面，常使用化学合成药物或抗生素类药物控制疾病的发生与流行，但在长期的药物使用中，药物在动物体中残留，危害到人类的健康，且长期用药带来环境污染，并导致耐药性微生物大量出现，同时已成为出口创汇的壁垒，严重影响了泥鳅养殖业的发展。目前泥鳅养殖生产中很难控制霍乱弧菌引起的疾病的发生与流行，市场上缺乏一种使用方便的抗泥鳅病原霍乱弧菌的免疫制剂。因此，应用免疫学技术预防泥鳅细菌性疾病的发生已成为泥鳅养殖产业持续、健康、稳定发展的重要内容，对于有效控制泥鳅病原霍乱弧菌病的发生与流行具有重要的应用前景。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高泥鳅针对病原霍乱弧菌的免疫力、降低泥鳅养殖生产中由病原霍乱弧菌所造成的危害、以满足泥鳅养殖生产上的抗病需求的抗泥鳅病原霍乱弧菌的卵黄抗体灭活疫苗的制备方法。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种抗泥鳅病原霍乱弧菌的卵黄抗体灭活疫苗的制备方法，其特点是：它以经甲醛溶液灭活后的泥鳅病原霍乱弧菌（Vibrio cholerae) NQ1作为免疫原，以白油、司班80、硬脂酸铝作油乳剂，以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将泥鳅病原霍乱弧菌NQ1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28-30℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至50-55℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为1-3：100 g / ml，继续加热至65-70℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为5-7：100，直至终温度115-120℃，维持15-20 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中泥鳅病原霍乱弧菌NQ1免疫原为10¹²cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的泥鳅病原霍乱弧菌油乳剂灭活疫苗。

本发明所述的泥鳅病原霍乱弧菌NQ1已经在公开文献《Identification of Vibrio cholerae as a causative bacterium for an ulcer disease of cultured loach Misgurnus anguillicaudatus in China》中所公开（菌株NQ1），上述公开文献发表于《African Journal of Microbiology Research》，2012，6（9）：2060-2070。菌株NQ1的DNA序列长度及Genebank登录号见下表： 

 

该菌株NQ1为公知公用材料，现保存在淮海工学院海洋学院实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外发放。