[发明专利]新型2-脱氧青蟹肌糖合成酶的制造方法

说明书

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/JP2010/002210，国际申请日为2010年3月26日，中国国家申请号为201080013139.X，进入中国国家阶段的进入日为2011年9月22日，国际公开发明名称译文为“新型2-脱氧青蟹肌糖合成酶”。

技术领域

本发明涉及耐热性2-脱氧青蟹肌糖合成酶、2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因、重组载体、转化体以及2-脱氧青蟹肌糖的制造方法。

背景技术

目前，许多邻苯二酚等芳香族化合物是以石油为原料而进行生产的，但从石油资源枯竭的问题、削减二氧化碳排放量等方面出发，要求开发出利用生物物质的环境协调型的新型制造工艺。

另一方面，有文献发现2-脱氧青蟹肌糖(以下称为DOI)能够转换为工业上有用的芳香族化合物(邻苯二酚等)(非专利文献1)，此外，有文献报道能够由作为生物物质的构成要素之一的葡萄糖来合成该DOI(非专利文献1)。在该DOI制造工艺中重要的是由葡萄糖-6-磷酸向DOI转换的2-脱氧青蟹肌糖合成酶(以下称为DOI合成酶)，DOI不仅能够转换为上述芳香族化合物，还能够成为各种有用化合物的中间体，因而DOI合成酶备受瞩目。

DOI合成酶是于1997年由属于丁酰苷菌素生产菌环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)的微生物分离纯化的(非专利文献2)，随后其基因序列也被公开(专利文献1)。除此之外，迄今为止还发现了来自印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)JCM3268株(非专利文献3)的DOI合成酶等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000-236881号公报

非专利文献

非专利文献1：Tetrahedron Letters41,1935-1938,2000

非专利文献2：The Journal of Antibiotics50(5),424-428,1997

非专利文献3：The Journal of Antibiotics59(6),358-361,2006

发明内容

发明所要解决的课题

但是，上述DOI合成酶的稳定性和比活性等各种特性并不令人满意，而且基本上没有进行与适合于数千吨规模的工业化制法的酶的分析和功能提高有关的研究。例如，来自属于环状芽胞杆菌的微生物的DOI合成酶(BtrC)在稳定性等方面存在很大的问题，来自印度斯坦链异壁菌JCM3268株的DOI合成酶的比活性明显较低，工业上难以利用。本发明所要解决的课题在于提供一种对于热和pH的稳定性等特性比现有的酶更优异的DOI合成酶，以及提供一种使用了该酶的DOI制造方法。

用于解决课题的方案

为了解决这些课题，本发明人进行了深入研究，结果发现了一种与现有的酶相比热和/或pH稳定性得到了提高的DOI合成酶，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下所示的DOI合成酶、DOI合成酶基因、重组载体、转化体以及DOI制造方法。

[1]一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性，且具有下述(3)和/或(5)的特性：

(1)作用：本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为2-脱氧青蟹肌糖的功能；

(2)最适pH范围：7.0～7.7；

(3)稳定pH范围：6.0～8.0；

(4)最适温度范围：55～70℃；

(5)稳定温度范围：20～46℃；

(6)辅酶：利用NAD⁺；

(7)分子量：39000～42000。

[2]如[1]所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(8)的特性：

(8)比活性：1.0μmol/min/mg以上(反应温度65℃)。

[3]如[1]或[2]所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(9)的特性：

(9)辅因子：通过添加Co²⁺离子提高活性。

[4]如[1]～[3]的任一项所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，稳定温度范围为20～60℃。

[5]一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述任一种氨基酸序列：

(a)序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列；