[发明专利]短稳杆菌GXW15-4野外驯化提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及对中国典型培养物保藏中心保藏的短稳杆菌（拉丁文学名为Empedobacter brevis）GXW15-4进行野外驯化、提纯，使之保持较高的杀虫活性，制备成适合短稳杆菌杀虫剂产业化生产用原种的方法，属于微生物技术领域。 

背景技术

植物的主要害虫是鳞翅目害虫。长期使用化学农药不仅导致农产品化学残留量加大，而且导致害虫对化学农药的抗药性增强，药效显著降低。例如，大剂量的常规化学杀虫剂对蔬菜小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等主要鳞翅目害虫的杀虫效果也只有60%甚至更低，农产品生产者和消费者因此对化学农药的使用普遍担忧。 

就对化学农药抗药性较强的小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等重大鳞翅目害虫的生物农药开发应用而言，国内外市场上主要产品仍然是50年前由日本人研究制造成功的苏云金杆菌杀虫剂（BT），长期使用也出现药效下降趋势。短稳杆菌杀虫剂是本公司自主开发成功的一种全新的细菌性杀虫剂，国内外首创，截止2013年3月已取得国家新农药全部生产许可证，同时取得中国绿色食品生产资料证书，现已正式投产，有希望成为苏云金杆菌杀虫剂（BT）理想的替代产品。 

需要指出的是：近年来，国内外农药市场上出现了一些植物源杀虫剂品种，但因植物源杀虫剂受植物品种和资源限制，产业化生产难度较大，且因植物源杀虫剂开发成本普遍较高，农户选择使用植物源杀虫剂的积极性不高。 

  

发明内容

短稳杆菌Empedobacter brevis（菌株号：GXW15-4）是镇江市润宇生物科技开发有限公司高级农艺师高小文于2001年9月解剖罹病死亡的斜纹夜蛾尸体发现的一种植物害虫病原菌。该菌于2002年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号CCTCC NO：M202046，保藏单位地址：武汉市武昌区珞珈山武汉大学。 

短稳杆菌GXW15-4个体形态特征为：菌体呈短杆状，长2.6-3.8μm，宽0.8-1.1μm，两端钝圆，无鞭毛，用扫描电镜观察其内部有约1μm³的正方晶体状。 

依据中国科学院微生物研究所检测鉴定报告（[2009]微检字第175号），短稳杆菌GXW15-4理化试验结果见表1： 

表1  短稳杆菌农药理化试验结果（BIOLIG GN2）表

短稳杆菌GXW15-4再生能力强，可在工厂化条件下大量繁殖，但在重复繁殖过程中往往会出现其杀虫活性下降现象。本发明是通过对中国典型培养物保藏中心保藏的短稳杆菌GXW15-4进行野外驯化、提纯手段保持其具有较高的杀虫活性、获得可以适合短稳杆菌杀虫剂产业化生产的优良菌种的一种方法。

本发明的产物是获得可以用于工厂化生产短稳杆菌杀虫剂的短稳杆菌GXW15-4原种。 

   具体实施方式

1、短稳杆菌GXW15-4野外驯化方式

野外驯化短稳杆菌GXW15-4步骤如下：

步骤一、在晴天室外温度37⁰C以上的夏季烈日下，将短稳杆菌杀虫剂按常规用药方法喷施在有4龄以上小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫的田间植物体上，喷施在植物体上的短稳杆菌GXW15-4经白天紫外线照射后，让小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫在夜间捕食并经口进入其体内；

步骤二、选择药后2天内死亡的小菜蛾或者斜纹夜蛾高龄幼虫尸体，晒干备用；

步骤三、将干瘪的小菜蛾或者斜纹夜蛾幼虫尸体粉碎后均匀撒布于无菌琼脂培养皿中培养24小时，获得野外驯化1次、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质；

步骤四、将获得的混合物质稀释，按照前（1）～（3）的步骤重复2次以上，获得野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质。

2、驯化后的短稳杆菌GXW15-4提纯方式 

提纯短稳杆菌GXW15-4是根据短稳杆菌GXW15-4 特征采取非相同特征淘汰法获得杂菌率小于2%的短稳杆菌GXW15-4优良原种的方法，步骤如下：

步骤一、提取野外驯化3次以上、含有高浓度短稳杆菌GXW15-4的混合物质，用无菌水稀释并涂布接种在无菌的琼脂培养皿中，在37⁰C条件下培养24小时；