[发明专利]一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用。

背景技术

DNA聚合酶广泛应用于分子生物学研究中，如DNA测序、标记、突变和核酸扩增等反应。耐热DNA聚合酶由于其热稳定性，在核酸高温变性的条件下不会失活，是目前核酸扩增的常用酶。根据序列的不同，DNA聚合酶可以分为六大族：A、B、C、D、X和Y，耐热DNA聚合酶主要属于A族和B族，并具有相似的生物学性质。A族DNA聚合酶的代表是Taq DNA聚合酶,该聚合酶分离自Thermus aquaticus YT-1的基因组，具有5’-3’的DNA外切酶活性和5’-3’DNA聚合酶活性，其菌株生长于75℃左右的温泉中，由于其能耐受高温变性，自发现后被广泛应用于PCR反应，目前已被开发成多种试剂盒；后来的研究又从其他物种中分离出了多种A族DNA聚合酶，但由于其不具有3’-5’的外切酶校正活性，容易在扩增时掺入错误的碱基，导致不能忠实地扩增模板，直到B族DNA聚合酶的发现，才使得高保真地扩增模板成为可能。B族DNA聚合酶主要分离自古细菌，包括广古菌、泉古菌、纳古菌和初古菌，其具有更高的热稳定性，同时其3’-5’外切酶校正活性能识别错误掺入延伸链中的碱基，并将其切下，利用DNA聚合酶活性添加为与模板互补的碱基，从而保证了新扩增链与模板的高度一致性。

超嗜热古菌具有严格厌氧和超嗜热生长的特性，如Pyrodictium和Methanopyrus属的物种能在110℃生长，而低于80℃则不能生长；从大西洋中脊3650米的超热烟囱中分离的Pyrolobus fumarii是目前已知最耐热的古菌，其能在高达113℃的高温条件下增值，而低于90℃则停止生长。目前已经从Pyrococcus和Thermococcus属中分离出了许多DNA聚合酶，某些DNA聚合酶在极高的温度下仍能保持稳定，被应用于分子生物学研究，尤其是核酸扩增中。其中，Pfu DNA聚合酶是一种来源于Pyrococcus furiosus的热稳定的DNA聚合酶，具有5’-3’DNA聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性。由于Pfu DNA聚合酶有3’-5’的外切酶活性，因此在核酸扩增过程中出错的机率大大降低，保真性约为Taq DNA聚合酶的6倍。目前，Pfu DNA聚合酶通常作为首选的高保真DNA聚合酶，用于核酸的高保真扩增，但是，在实际应用过程中，Pfu DNA聚合酶对引物和样品的结构、纯度和浓度要求比较高，反应灵敏度较低，扩增效率较低，限制了Pfu DNA聚合酶的使用和推广。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高扩增效率的高保真DNA聚合酶及其制备和应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种高保真DNA聚合酶，命名为Tco DNA聚合酶，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。

本发明提供了一种Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。

本发明提供了一种编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，其具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：

Ⅰ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

Ⅱ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。

本发明提供了一种重组载体，其含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，该DNA分子具有具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：

Ⅰ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；