[发明专利]双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光成像检测，尤其是涉及一种双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置及检测方法。

背景技术

由于具有高的灵敏度，荧光分析技术在现代生化研究与疾病诊断等领域具有广泛的应用。然而，为了检测低浓度或复杂基底下的分析物，人们仍致力于发展新型荧光技术及仪器，以进一步提高荧光的灵敏度。表面等离子体耦合发射荧光法（Surface Plasmon Coupled Emission,SPCE）由于具有荧光增强，定向发射，高度偏振性，距离敏感性，光谱分辨和背景抑制等独特性质，逐渐引起科研工作者的兴趣。SPCE的原理为：处于光滑纳米金属表面200nm范围的激发态荧光团与金属表面的等离子体耦合作用后，以荧光发射波长对应的SPCE角（即θ_SPCE）进入棱镜基体辐射。而在自由空间（Free Space,FS）发射中，由于荧光发射在空间上是各向同性的，所检测到的信号不足总荧光强度的1%，与之相比，SPCE的荧光收集效率可达到50%。

根据样品激发方式的不同，SPCE可分为克莱彻曼模式（Kretschmann模式，即KR模式）和反式克莱彻曼模式（Reverse Kretschmann模式，即RK模式）。在KR模式中，入射光由棱镜一侧以表面等离子体激发角度入射到金属膜表面，引发表面等离子体，产生瞬逝场，从而激发金属表面的荧光团样品膜，激发态的荧光团与金属表面的等离子体发生耦合作用后，通过棱镜定向辐射。在RK模式中，入射光直接照射到荧光团样品膜，近表面的激发态荧光团和金属3表面的等离子体发生耦合作用并通过棱镜定向辐射。因此，在SPCE中，激发态的荧光团与金属表面的作用，与激发方式无关。

SPCE自提出以来，研究方向主要为荧光机理研究、金属基底优化、仪器结构设计、分析应用检测等方面，本申请人在专利号为200910111882.8的中国专利中公开一种表面等离子体耦合荧光检测装置，是一种结构简单、易于实验室操作和推广的SPCE荧光光谱检测装置。近年来，基于SPCE的成像研究也获得了极大的关注。在SPCE中，将棱镜替换成物镜，也可实现SPCE检测。大多数的SPCE成像研究主要是基于物镜型结构的装置，由于物镜型装置价格极其昂贵，操作复杂，设计繁琐，加工复杂且波长适用范围窄，因此，本申请人又在公开号为CN102539404A的中国专利中公开一种定向发射荧光成像检测装置，是一种基于棱镜构型的RK模式SPCE成像检测装置。与物镜型的SPCE成像装置对比，基于棱镜构型的RK模式SPCE成像装置，入射光直接照射样品表面，无需KR模式中的精密调整入射角度，装置结构简单、成本低廉、操作简便，波长检测适用范围更广，能检测到的有效成像区域更大，在中高密度的微阵列芯片检测中具有独特的优势。然而，上述基于棱镜构型的RK模式SPCE成像装置，也存在以下不足之处：该成像装置模式单一，功能简单，由于其入射光路固定，入射光角度无法改变，因此仅能进行RK模式的SPCE成像。而在RK模式中，其荧光的增强主要是来自于收集效率的提高，目前报道的RK模式的SPCE成像荧光增强效果差强人意（仅约为2倍），应用于低浓度及复杂基底存在下的生物样品检测时，由于荧光信号太弱，常常遇到较大的瓶颈和挑战。与RK模式相比，KR模式的SPCE除了荧光收集效率的提高外，由于瞬逝场激发作用的参与，增强了激发荧光团的能量，因而有更好的荧光增强效果。但KR模式SPCE成像检测，只有以表面等离子体激发角入射的激发光才能引发表面等离子体产生瞬逝场，因此需调整入射光的角度；同时，激发光及其反射光与发射光的角度差较小，需要采用高性能的滤光片去除激发光或其反射光的干扰，因此，在单一模式下，无论是KR模式或者RK模式的SPCE成像装置，在研究和应用中都常常遇到较大的瓶颈和挑战，限制SPCE成像技术的推广。

发明内容

本发明的目的旨在克服上述现有检测装置存在的缺点，综合考虑KR和RK两种模式SPCE各自的优势与不足，提供一种基于棱镜构型，可实现不同模式下成像检测的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置。

本发明的另一目的旨在提供一种双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测方法。

通过所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置既可以进行RK模式的SPCE成像检测，也可实现KR模式下的SPCE成像检测，有效地发挥KR和RK模式SPCE的各自优势，避免了单一模式时存在的问题。

本发明所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置设有样品系统、入射臂系统和检测臂系统；