[发明专利]一种提取纯化透明质酸的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及生物制品领域，尤其是一种提取纯化透明质酸的生产方法。

背景技术

透明质酸，简称HA，是N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸由β-1,4糖苷键链接而成的酸性高分子粘多糖。其具有良好的亲水性、生物相容性和保湿功能，已广泛应用于化妆品、食品、医药领域。透明质酸的生产方法主要包括：提取法和微生物发酵法，其中，提取法受原料来源制约，不能大规模生产，而发酵法则具有原料来源广泛的特点，因而已成为工业化生产HA的主流。发酵法生产透明质酸是利用兽疫链球菌将糖转化成HA，其具有原料易得、来源广泛的特点，适于工业化大规模生产。

发酵法生产透明质酸的发酵液中，除HA外，还含有大量的菌体蛋白（酸性蛋白、碱性蛋白）、核酸（DNA、RNA ）、色素、金属离子及其它杂质，必须通过必要的手段和方法将HA分离纯化。分离纯化的目的就是将发酵液中的HA提取出来，并纯化达到一定质量标准。

目前，发酵法生产透明质酸的提取纯化技术通常采用CPC络合乙醇沉淀技术纯化，其具体工艺流程如下：HA复溶→CPC络合→离心分离→解离→过滤→醇沉絮凝→离心分离→溶解→醇沉结晶→离心分离→脱水→真空干燥→粉碎→包装。CPC络合乙醇沉淀技术是依据在特定浓度的NaCl溶液中，CPC络合和解离HA，再用乙醇沉淀分离，最终达到分离提纯透明质酸的目的。其中，CPC的中文名称为：氯化十六烷基吡啶，其是一种络合剂，其价格较高，国产CPC每公斤售价200元左右，进口的CPC每公斤售价400元左右。采用该工艺每生产1公斤透明质酸（HA）需要使用2—3公斤氯化十六烷基吡啶（CPC），仅CPC的原料成本就高达400—1200元，同时，解离过程需要在低温下进行，因此还需要配置冰水机组，进行降温、保温，增加了制冷机动力费用。

现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在如下缺点：工艺线路长、生产周期长、劳动强度大，影响产品质量的人为因素较多，产品收得率相对较低。该工艺的工艺线路、生产周期长，共17道生产工序，总用时为48个小时左右。同时，由于工序较多，产品收得率也相对较低。而且，采用该方式还存在另一质量风险问题，即：分子量降解。据生产试验验证，采用该方式的分子量损失为10-20%，有可能因为分子量降解而导致产品不合格。

现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在上述缺陷，因此需要对现有工艺进行改进和创新，克服现有技术的不足。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在工艺线路长、生产周期长、劳动强度大，影响产品质量的人为因素较多，产品收得率相对较低的问题，提供一种提取纯化透明质酸的生产方法。本发明针对现有的CPC络合乙醇沉淀技术纯化存在的问题，提供一种用于兽疫链球菌发酵法生产透明质酸的发酵液的工业提取纯化方法，该方法具有工艺线路及生产周期短，适应性强，生产成本低，效果好的特点。该方法可以概括为“二次过滤二次醇沉提取工艺”，并经过了实验室小试、中试以及实际生产的检验，证明该方法切实可行，能够满足工业化生产的需要。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提取纯化透明质酸的生产方法，包括如下步骤：

（1）发酵液灭活：将发酵液装入第一发酵罐中，搅拌，搅拌转速为40-100转/min，再向第一发酵罐中加入三氯乙酸，调节发酵液的pH值至4.0-4.5，搅拌30-80min，得灭活发酵液；

（2）一次醇沉：将灭活发酵液转移至第一沉淀罐中，向第一沉淀罐中缓慢加入灭活发酵液体积2-2.5倍浓度95%的乙醇，开启第一沉淀罐中的气浮装置，同时搅拌30-60min；

（3）粗分：搅拌完成后，收集灭活发酵液上浮的透明质酸粗产品和第一沉淀罐底部的透明质酸粗产品，混合得第一透明质酸粗产品；

（4）复溶：将第一透明质酸粗产品转移至第二沉淀罐中，向第二沉淀罐中加入第一透明质酸粗产品体积1.5-3倍的去离子水复溶，得复溶液，再向复溶液中加入NaCl，使复溶液中NaCl的摩尔浓度为0.2-0.6mol/L，再向其中加入复溶液质量1%-3%的助滤剂、复溶液质量0.1%-2%的活性炭、复溶液质量0.02%-0.04%的EDTA，搅拌10-30min后，得第二复溶液；

（5）一次过滤除杂：将第二复溶液用板框过滤机过滤，收集滤液，得一次滤液；

（6）二次过滤净化：向一次滤液中加入一次滤液质量1%-3%的珍珠岩，再向第一滤液中添加氢氧化钠，调节第一滤液的pH值至8.5-9.0，搅拌20-50min，得二次滤液；