[发明专利]一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法。

【背景技术】

组织工程是当前国内外研究的热点领域，其中如何成功构建细胞与支架复合体以形成组织是组织工程研究中的一个关键问题。

当前组织工程组织构建的基本思路是先制备支架材料，然后将种子细胞移植到支架材料上，经过一定时间的培养，在体外或体内构建组织和器官。关于支架材料研究非常广泛，各种合成材料、天然生物材料以及复合材料已经广泛应用，而且通过快速成形技术，已经能够制造出与缺损组织三维结构完全匹配的组织工程支架材料。但是组织构建过程中也暴露出一个问题，如何保证细胞在三维支架材料中的分布且生长不受影响？目前采用的基本思路是提高支架的孔隙率和连通率，一些研究者也探讨了细胞的植入方式或培养方法对提高细胞的分布及生长繁殖的影响，如采用动态、磁力、真空、静电、离心等方式。那么是否可以打破支架制备→注入细胞→培养构建这一传统的组织构建方式，尝试其它有效的构建方式来提高细胞的分布生长繁殖呢？可注射水凝胶目前成为研究者的一个热点，它所采用的构建方式是细胞材料混合→制备支架-细胞复合体→培养构建。

此外，研究者也提出了一些新的组织构建思路。考虑到支架材料自身降解率、降解产物的毒性、对细胞通讯的影响、对周围组织的磨损、对细胞形态的改变等，一些研究者采用了无支架的组织构建方式，即细胞→培养构建。2007年，美、奥、德的研究者在内源性修复的基础上，联合提出了“促生内源性修复”(Facilitated endogenous repair)这一新的组织构建方式，其基本策略是采用分子刺激，例如基因转移，利用内源性组织自身的再生潜力，促发原位再生，其构建方式为分子刺激→组织再生。最近，自下而上(Bottom-up)的组织构建方式也逐渐引起了研究者的兴趣。例如Mcguigan等提出了模板组织构建的策略，将HepG2细胞与胶原混合固化制成亚毫米模板，模板外表面植有内皮细胞，将模板塞入一个大的试管，试管两端连接微泵系统用于培养液的供给。2005年，Malafaya等提出了一种创新性的组织构建方式，利用微球融合作为细胞载体进行组织构建。由于微球载体具有较大的比表面积，因而有利于细胞的黏附生长，这一构建方式近年来引起了一些研究者的关注。

由以上可见，研究者在组织构建的同时，不断探索新的组织构建的方式，而且取得了一些不错的效果，但是不同组织构建方法之间仍然存在着一些问题，例如，体内构建的规模化，微球融合构建的低连通率，无支架培养获得的组织尺寸，水凝胶材料固化对细胞生长空间的影响等等，因此，我们考虑是否可采用这样一种构建方式：参考微球融合的bottom-up构建方式，但是细胞是在微球内部生长，内部环境为液态，细胞的生存空间足够，从而降低组织工程对支架材料孔隙率、连通率的要求。同时考虑到体外组织构建成功有可能促进组织工程产品的规模化、产业化，因此我们设计了一种新的组织工程构建方式：结合水凝胶与bottom-up的概念，利用“人工细胞”为基元体外构建组织。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，能够降低传统支架对高孔隙率及高连通率的要求，且制备方法简单，有利于实现体外构建的大规模生产。

本发明是这样实现的：

一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，所述方法步骤如下：

步骤10、将细胞悬液浮于过滤除菌的海藻酸钠溶液中，并通过滴液发生装置滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钙胶珠；

步骤20、将用生理盐水清洗过后的胶珠置于含膜材的溶液中，使胶珠表面覆上一层膜，形成微胶囊；再将微胶囊表面多余的正电荷进行中和；

步骤30、采用柠檬酸钠溶液使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，即形成人工细胞；再将人工细胞和水凝胶的混合物固化成型，最后形成以人工细胞为基本结构单元，水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体；

步骤40、将人工细胞-水凝胶复合体置于静态或振荡或微重力的条件下培养，以构建组织工程化组织。

进一步地，所述步骤30还可以为：将微胶囊与水凝胶的混合物固化成型后，加入柠檬酸钠，使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，最后形成以人工细胞为基本结构单元、水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体。

本发明具有如下优点：

第一、由于生物微胶囊(即人工细胞)及水凝胶通透性较好，降低了传统支架对高孔隙率及高连通率的要求；