[发明专利]一种快速低成本纯化CYP119酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速且成本低廉地纯化CYP119酶的方法，属于酶纯化技术领域。

背景技术

CYP119（细胞色素P450 119）酶是一种细胞色素P450酶。CYP119酶来源于生长于高温火山温泉环境中的原始细菌Sulfolobus solfataricus，具有超常的稳定性和耐受性。它的热变性温度高达90℃，并可以耐受200 MPa以上的高压和极端的pH条件。基于以上特点，CYP119酶是极佳的生物催化剂，是蛋白质工程的理想目标，在生物制药、生物合成等领域具有极其重要的应用价值。

目前CYP119酶的合成技术已经较为成熟，通常都是将CYP119酶的基因装载入特定的表达载体，再转化进特定的大肠杆菌细胞内，利用大肠杆菌进行生物合成。但是从合成了CYP119酶的大肠杆菌裂解液中提纯CYP119酶的技术是一个难点，目前方法较为单调、耗时较长且花费昂贵。例如：Rabe等人利用Ni-NTA亲和树脂柱和MonoQ阴离子交换树脂柱纯化CYP119酶[ChemBioChem 2008, 9, 420-425]；Koo等人利用Q Sepharose树脂柱和PBE94树脂柱纯化CYP119[J. Biol. Chem. 2000, 275(19): 14112-14123]; Blair等人利用QAE-Sepharose-25树脂柱纯化CYP119酶。这些纯化方法的特点都是利用亲和树脂柱来提纯。酶与亲和树脂的结合、洗涤、洗脱等步骤都要用到多种不同的缓冲溶液，操作起来费时费力，而且所用的这些树脂的价格很高，这为大规模批量化纯化CYP119酶带来了不便。

本方法涉及只利用热沉淀和盐析技术从大肠杆菌中提纯CYP119酶，方法中只用到一种缓冲溶液，主要化学试剂是廉价的(NH₄)₂SO₄和KH₂PO₄，具有方便快速、成本低的特点，本方法涉及的只利用热沉淀和盐析技术从以pCWori为表达载体、以大肠杆菌DH5α为宿主菌的菌体裂解液中提纯CYP119酶的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速低成本纯化CYP119酶的方法。

本发明采用如下手段：

（1）将含有CYP119酶的菌体裂解液，在60℃加热1小时，离心去除沉淀，收集上清；

（2）在0.5小时内逐渐向由（1）所得上清中加入(NH₄)₂SO₄固体，至(NH₄)₂SO₄最终质量浓度为40%，离心去除沉淀，收集上清；

（3）在0.5小时内逐渐向由（2）所得上清中加入(NH₄)₂SO₄固体，至(NH₄)₂SO₄最终质量浓度为60%，离心去除上清，收集沉淀；

（4）将由（3）所得沉淀用10 mM KH₂PO₄缓冲溶液（pH=2）在4℃缓慢搅拌溶解，即得到CYTP119酶的溶液。

本发明的优点是：（1）得到的CYP119酶纯度高，从SDS-PAGE胶表征的结果来看，通过本方法纯化得到的CYP119酶的纯度在80%左右； （2）得到的CYP119酶的活性好，从UV谱图表征结果看，通过本方法得到的CYP119酶保持着正确的构象，具有很高的生物活性；（3）纯化条件温和，工艺操作简便，时间短，成本低，适用于大规模提纯CYP119酶。 

附图说明

图1为本发明所得CYP119酶的SDS-PAGE胶图。图上第1条道为纯化后的CYP119酶，第2条道为分子量Marker。

图2为本发明所得CYP119酶的UV光谱图。

具体实施方式

实施例1

本发明所涉及的CYP119酶的表达载体为pCWori，宿主菌为大肠杆菌DH5α，CYP119酶的表达及大肠杆菌体的裂解采用的是常规通识的方法和步骤；

含有CYP119酶的大肠杆菌菌体经过裂解后，将裂解液在60℃条件下加热1小时，15000r/min离心20分钟，去除沉淀蛋白，将上清倒入一个干净的烧杯；将上清置于在4℃环境下，缓慢搅拌，同时缓慢地加入(NH₄)₂SO₄固体，在半个小时内加完(NH₄)₂SO₄，使其最终质量百分比浓度达到40%。再在4℃缓慢搅拌2小时后，在4℃下10000r/min离心15min，去除沉淀蛋白，将上清倒入一个干净的烧杯；将上清在4℃条件下缓慢搅拌，同时缓慢地加入(NH₄)₂SO₄固体，在半个小时内加完(NH₄)₂SO₄，使其最终质量百分比浓度达到60%，再在4℃缓慢搅拌2小时后，在4℃下10000r/min离心15min，去除上清，将沉淀转入干净小烧杯；将沉淀溶解于10 mM KH₂PO₄缓冲溶液，pH=7.2，在4℃缓慢搅拌至沉淀完全溶解，得到红色溶液，即为纯化的CYP119酶溶液。如图1所示，图1为本发明所得CYP119酶的SDS-PAGE胶图。图上第1条道为纯化后的CYP119酶，第2条道为分子量Marker。本发明所得CYP119酶的SDS-PAGE胶图显示CYP119酶的纯度在80%左右；如图2所示，本发明所得CYP119酶的UV光谱图显示在416nm处可见明显的尖峰，在535 nm和565 nm可见两个明显的包峰，表明CYP119酶保持着正确的构象，具有很高的生物活性。