[发明专利]奶牛瓣胃上皮细胞体外分离、培养以及保存和复苏方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织与细胞工程、转基因动物等研究领域，特别是上皮细胞的分离、纯化、培养、冻存和复苏的方法。

背景技术

瓣胃上皮可以吸收大量小肽和氨基酸等多种营养物质，对奶牛营养吸收有重要意义。动物细胞培养模型在一定程度上模拟体内环境而广泛应用于医学、生物学、毒理学和营养学等领域，可用于研究细胞的形态、生长发育、细胞营养和代谢以及病变等微观过程，进行外源性物质吸收机制、转运途径及作用机理等方面的研究。从复杂的器官体外培养到简单的单一上皮细胞培养，可以很好的解决对于特定因素研究的问题，国内外很少有对奶牛瓣胃上皮细胞的体外培养的报告，并且仅限于短期的原代培养，对于其形态学、免疫鉴定、微观结构观察、冷冻保存以及吸收功能的研究就更少了；通过研究瓣胃上皮细胞的吸收功能和相关基因的表达，可以揭示奶牛前胃是如何吸收小肽等营养物质的、奶牛相关营养物质转运载体的吸收特征以及营养供应和相关基因表达间的关系。

细胞的原代培养是从体内取出细胞开始培养到第一次进行传代之前的时期，是一个特征性的必然生长阶段。细胞完成了从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育的能力；对瓣胃上皮细胞的原代培养是构建细胞吸收模型系统的基础。

瓣胃上皮细胞是高度分化的体细胞，其体外培养存在一定的困难，特别是细胞原代分离所需的胰蛋白酶浓度和消化时间，这两个因素对分离下来的细胞活力影响很大，关系到原代培养的成功与否，目前对于奶牛瓣胃上皮细胞的体外培养技术一直不成熟，也很少有文献报道，本发明找到了分离瓣胃上皮细胞的最佳酶浓度和消化时间等因素，从而解决了这一难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种奶牛瓣胃上皮细胞体外分离、培养以及保存和复苏方法。

一种奶牛瓣胃上皮细胞体外分离方法，包括以下步骤：

1）瓣胃组织的取样

选用已经与奶牛相分离的瓣胃，剪取瓣胃叶，清洗、处理后得到瓣胃组织块，备用；

2）细胞分离

将步骤1）所得的瓣胃组织块放入容器中，加入2%～3%（M/V）的胰蛋白酶消化液消化1 h，弃上清液，再加入胰蛋白酶消化液继续消化30 min，取上清液观察，当视野中出现大量形态结构一致的细胞时，开始收集上清液得到含有细胞的收集液，此后每15-30 min收集一次，并向各收集液中加入血清终止消化，所得的细胞悬液经过滤和离心，得到分离的瓣胃上皮细胞。

 步骤1）中，所述的清洗中清洗液为添加了5倍双抗和2倍两性庆大霉素D-Hanks液；步骤2）中质量百分比浓度为2%～3%胰酶的消化液是用D-Hanks液配制的。

 一种所述的方法得到的分离的瓣胃上皮细胞的培养方法，用含抗生素的D-Hanks液清洗所述的分离的瓣胃上皮细胞多遍；然后调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于铺过鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下利用瓣胃上皮细胞培养液培养得到原代培养的瓣胃上皮细胞；所述的瓣胃上皮细胞培养液通过每毫升DMEM培养液中添加0.1 ml胎牛血清、10 ng表皮生长因子、5 μg胰岛素、6.8 μmol谷氨酰胺、100 IU青霉素、100 μg链霉素和2.5 μg两性霉素B制备得到。

所述的分离的瓣胃上皮细胞进一步纯化，所述的纯化方法为刮除法、差酶法、或差速贴壁法。

所述的分离的瓣胃上皮细胞进一步纯化后，经离心得瓣胃上皮细胞，接着用所述的培养液清洗后；去掉上清液，用所述的培养液重新悬浮细胞，并调整细胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接种于细胞培养瓶，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔1天换一次液得到传代培养的瓣胃上皮细胞。

 一种得到的原代培养的瓣胃上皮细胞或得到的传代培养的瓣胃上皮细胞的保存和复苏方法，包括以下步骤：

1.1）制备冷冻保护液

冷冻保护液由以下体积百分比的组分组成：10% DMSO、20%胎牛血清和70%细胞悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM基础培养基形成的混合物，装于冻存管中，所述细胞为纯化后的原代培养的瓣胃上皮细胞或传代培养的瓣胃上皮细胞；

2.1）将上述步骤1.1）所得的冷冻保护液逐步慢速降温：

a、将冻存管放入加了新鲜异丙醇的冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜，降温速率为1℃/min；