[发明专利]一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌。

技术背景

芽孢杆菌是分泌型基因工程宿主菌。研究表明，很多外源蛋白也在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达（表1），因此，用枯草芽孢杆菌生产外源蛋白越来越为人们所关注。

表1在枯草芽孢杆菌中表达的重组蛋白

芽孢杆菌作为外源基因的表达系统有以下几个优点：枯草芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统，从而能够高效的分泌目的蛋白，也简化了目的蛋白的分离纯化步骤，而且在多数情况下，芽孢杆菌分泌的重组异源蛋白具有天然构象和生物活性；芽孢杆菌严格好氧、生长迅速、培养条件简单、大规模发酵技术成熟；多数芽孢杆菌使用安全，无致病性；密码子无偏爱性，转录翻译机制、遗传背景较清楚。

目前对枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属的基因改造主要集中在通过遗传导入表达质粒实现游离表达，但是通过此种方法构建的工程菌遗传特性不稳定。在生产过程中需加入抗生素防止质粒丢失，很难普及到工业生产上。另外，采用同源重组方法将表达基因整合到染色体上，但是只能整合上一个拷贝数，且同源重组效率较低，效果不明显。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌，本发明的质粒可以将各种目的基因整合在芽孢杆菌属各种菌上，并可以获得含有不同拷贝数目的基因的转化子，实现目的基因在芽孢杆菌属的稳定高效表达

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒，包括序列8的线性片段。

而且，所述质粒以16SrDNA的序列作为同源臂，同源臂之间为卡那抗性筛选标记基因、P43启动子、多克隆位点、终止序列。

而且，所述序列8的线性片段连接在质粒pMD18Tsimple-16SrDNA的pstI酶切位点。

一种芽孢杆菌工程菌，利用适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒构建得到。

一株嗜碱芽孢杆菌工程菌，利用适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒，将多拷贝目的基因apr4M整合到染色体16SrDNA上的工程菌。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明在分析16SrDNA序列高度保守，拷贝数高且具有反馈调节作用（插入致死一个或几个拷贝的16SrDNA，16SrRNA的总量保持不变，不会影响菌体正常的生长代谢活动）的特性的基础上，设计并构建了本发明提供的适用于芽孢杆菌属同源重组质粒，解决了通过游离表达改良菌种遗传特性不稳定以及很难通过同源重组方法将表达基因以多拷贝的形式整合到染色体上的问题，利用本质粒成功的构建了含有不同拷贝数的嗜碱芽孢杆菌工程菌，所构建工程菌的单位细胞产酶量较野生型提高了278%左右。

2、本发明的质粒可以将各种目的基因整合在芽孢杆菌属各种菌上，并可以获得含有不同拷贝数目的基因的转化子，实现目的基因在芽孢杆菌属的稳定高效表达。此外，利用此质粒构建了pKD314-apr4M重组质粒，并且通过同源重组方法获得了含有不同拷贝数稳定高产的工程菌。

附图说明

图1为本发明中同源重组载体pKD314结构图；

图2为本发明所构建不同拷贝数目的基因初筛结果；

图3为本发明所构建重组质粒pKD314-apr4PCR验证图；

图4为本发明所构建菌株中PCR验证的核酸电泳图其中M:DNAMarker1、2：同源重组成功，3：未被重组；

图5为本发明所测酶活测定的标准曲线。

具体的实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒：以16SrDNA的序列作为同源臂，同源臂之间为卡那抗性筛选标记基因、P43启动子、多克隆位点、终止序列。

一株嗜碱芽孢杆菌工程菌，利用由pKD314构建的质粒pKD314-apr4M将多拷贝目的基因整合到染色体16SrDNA上的工程菌。

上述同源重组质粒以及嗜碱芽孢杆菌工程菌的构建及检测步骤是：

一、构建pMD18Tsimple-16SrDNA质粒。

二、kan抗性基因连在全序列合成表达调控原件psg（P43启动子、多克隆位点、终止序列）上，构建kan-psg。表达调控原件psg具体序列见序列7。