[发明专利]一种用于检测BCR/ABL融合基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测BCR/ABL融合基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法。 

背景技术

慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）BCR/ABL基因重排。 

人ABL基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2～11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种信使RNA（mRNA）长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。90%以上的CML患者的血细胞中出现9号染色体长臂上C-abl原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点集中区（BCR），形成BCR/ABL融合基因。此基因产生一种新的mRNA，编码的蛋白具有增强酪氨酸激酶的活性，改变了细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，从而扰乱了细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，并抑制了凋亡的发生。BCR/ABL融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。 

酪氨酸激酶在CML的发生中起了关键作用，抑制其活性成为CML治疗的一个新途径。目前已经合成了较特异的BCR/ABL酪氨酸激酶抑制剂，即STI-571（伊马替尼，格列卫）。伊马替尼是2-苯氨嘧啶衍生物，它可以选择性地阻断ATP与ABL激酶结合位点，有效地抑制BCR/ABL激酶底物中酪氨酸残基的磷酸化，使该酶失活，进而阻止了一系列的信号传导。实验表明，伊马替尼不杀伤BCR/ABL阴性细胞，只杀伤BCR/ABL阳性细胞，因此BCR/ABL融合基因的检测成为CML诊断和治疗的关键。 

目前，临床上用于检测基因重排、融合、扩增等突变类型的金标准是荧光原 位杂交技术。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。利用特定核酸经荧光素标记后作为探针，与靶DNA进行杂交后，再通过荧光显微镜直接以单个细胞为观察对象进行计数，可以在36小时内实现对待测染色体片段的定性、定量和定位分析。然而荧光原位杂交探针主要使用人工染色体制备，这些人工染色体包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）和噬菌体人工染色体（PAC）等，由于在人工染色体中存在很多的重复序列，这些重复序列在整个基因组中不断出现，从而导致制备的荧光原位杂交探针存在很多的重复序列，这些重复序列在探针与非靶DNA杂交后也能产生荧光，从而产生非特异性的荧光信号，大大降低了FISH检测的特异性和灵敏度。因此，本领域迫切需求开发BCR/ABL基因的不含重复序列FISH探针试剂盒，用于提高BCR/ABL基因的荧光原位杂交实验的特异性和灵敏度。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测BCR/ABL基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法。 

一种用于检测BCR/ABL融合基因不含重复序列的FISH探针，所述FISH探针DNA是以BCR基因和ABL基因为模板，由42对引物组或与引物组具有同一性的核苷酸序列，采用聚合酶链技术进行PCR扩增反应制备得到，所述引物组中1-20为BCR基因引物组，21-42为ABL基因引物组，所述引物组为（其中1、2、3……42为引物名称，F为上游引物，R为下游引物）： 

1F：5'  TCTCCCTCGCAGAACTCGC  3' 

1R：5'  CAAACCACCTCCCATCCCT  3' 

2F：5'  GTGCCTGTCAACTTTCTTCC  3' 

2R：5'  ATCTGCCCACTCTGTCTCC  3' 

3F：5'  AGCAATCAGCACATTCATAGACC  3' 

3R：5'  AGAACCTGCACAACAGACCAC  3' 

4F：5'  AAGCAACCTACAGGCAACA  3' 

4R：5'  TGAGCCCTCCACCTAAAA  3' 

5F：5'  AGTTCCTGCTTGGCTTTCA  3' 

5R：5'  TTCAGCTTCATCATTTACGG  3' 

6F： 5'  GGAGACCGCCAAGTATTTTCA  3'